Identificação de microRNAs diferencialmente expressos em carcinomas serosos de alto grau de pacientes com distintas evoluções clínicas / Identification of microRNAs differentially expressed in high grade serous carcinomas of patients with different clinical evolutions

RESUMO

Introdução: O tratamento do câncer epitelial de ovário é baseado na combinação de cirurgia e quimioterapia (principalmente carboplatina e paclitaxel). Embora o tratamento seja eficiente em 80% dos casos, a taxa de sobrevida de 5 anos é baixa devido à alta taxa de recorrência e resistência ao tratamento medicamentoso. Os processos moleculares que influenciam na resposta terapêutica e mecanismos que acarretam na sobrevida das pacientes ainda não são completamente compreendidos, e por este motivo, torna-se necessário a identificação de moléculas que possibilitem a melhor compreensão. Muitos estudos relatam a importância dos miRNAs no desenvolvimento e progressão do câncer de ovário, entretanto, tendo em vista a heterogeneidade do câncer ovariano, este estudo se diferencia por selecionar uma casuística clinicamente homogênea. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi caracterizar o perfil da expressão de miRNAs em amostras clinicamente homogêneas de adenocarcinoma seroso de alto grau, a fim de identificar miRNAs que estão envolvidos no processo de resistência ao tratamento quimioterápico e capazes de diferenciar pacientes com distintas evoluções clínicas. Metodologia: Foram selecionadas trinta e três amostras de adenocarcinoma seroso de ovário de alto grau, provenientes do banco de tumores do A.C.Camargo Cancer Center, oriundas de cirurgia com ressecção ótima cujas pacientes tinham estadiamento III e passaram por acompanhamento clínico mínimo de 2 anos. Destas 25 amostras foram provenientes de tumor primário, 8 de metástases primárias pareadas de pacientes que apresentaram recidiva e 5 amostras de epitélio de tuba de falópio de pacientes sem histórico de câncer como controle normal. A identificação dos miRNAs diferencialmente expressos nas pacientes com distintos desfechos clínicos foi realizada através da plataforma de larga escala de expressão de miRNAs humanos (G4870A ­ ID 031181; 8x60K, Agilent Tecnologies). As probes foram filtradas e normalizadas utilizando o software BRB ArrayTool (v. 4.4.0). Os alvos foram preditos usando miRWalk 2.0 (http//www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/custom.html), em quatr diferentes algoritmos (miRWalk, RNA22, miRanda and Targetscan). Para a análise do perfil entre miRNAs e transcritos codificadores, 415 amostras foram obtidas do The Cancer Genome Atlas (TCGA) (http//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) e essa interação foi submetida a um teste de correlação de Pearson. Os miRNAs diferencialmente expressos em diferentes desfechos clínicos foram validados pela técnica de in situ hybridization (ISH) em 114 amostras de adenocarcinoma seroso de alto grau incluídas no TMA proveniente do departamento de Anatomina Patologica do Hospital AC Camargo e em diferentes amostras provenientes do TCGA. Os alvos dos miRNAs validados foram associados a sobrevida global e livre de doença em amostras do TCGA e confirmados em amostras contidas no TMA da casuística interna através da técnica de Imuno-histoquímica. Resultados: A análise de comparação da expressão diferencial de miRNAs entre controle normal e de seroso de alto grau seroso demonstrou que 365 miRNAs foram diferencialmente expressos e foram encontradas 613 interações inversamente correlacionadas. Os miRNAs miR-934 e miR-143 foram associados a pior sobrevida global em nossa casuística, o miR-503-5p com resistência a quimioterapia. Apenas o miR-934 foi validado no TCGA e pela técnica de ISH. O alvo FZD3 foi predito para o miR-934 e miR-143 e foi negativamente correlacionado com ambos miRNAs em células tumorais de ovário. A expressão da proteína FZD3 por imuno-histoquímica demonstrou que esse receptor não foi expresso na membrana celular e sim no citoplasma e núcleo nos tumores de alto grau seroso. Conclusão: Diversos miRNAs tem participação na progressão do tumor de ovário. O miR-934 foi encontrado aumentado nas amostras metastática e em tumores primários e foi associado a pior sobrevida global, bem como o aumento citoplasmático de FZD3, alvo do miR-934, contudo este não foi associado a expressão de Beta-catenina. Sugere-se assim que outras vias de sinalização possam estar envolvidas neste contexto (AU)

ABSTRACT

Introduction: The treatment of epithelial ovarian cancer is based on the combination of surgery and chemotherapy (mainly carboplatin and Plactaxel). Although treatment is effective in 80% of cases, the 5 year survival rate is low due to the high recurrence rate and drug treatment resistance. The molecular processes that influence the therapeutic response and mechanisms that lead to the patient's survival are not yet fully understood, and for this reason, it becomes necessary to identify molecules that allow the best understanding. Many studies report the importance of miRNAs in the development and progression of ovarian cancer, however, in view of the heterogeneity of ovarian cancer, this study differs by selecting a clinically homogeneous casuistic. In this context, the objective of the present study was to characterize the profile of the expression of miRNAs in clinically homogeneous samples of high-grade serous adenocarcinoma, in order to identify miRNAs that are involved in the process of resistance to chemotherapic treatment and able to differentiate patients with different clinical developments. Methodology: A total of 33 specimens of high-grade ovary adenocarcinoma were selected from the tumor Bank of the A C Camargo Cancer Center, extracted from surgery with optimal resection whose patients had staging III and passed through clinical accompaniment of at least 2 years. Of these 25 samples were derived from primary tumor, 8 from primary metastasis of relapsed patients (paired) and 5 samples from fallopian epithelium tube of patients with no history of cancer as normal control. The identification of MiRNAs differentially expressed in patients with different clinical outturns was performed through the large-scale human miRNAs expression platform (G4870A ­ ID 031181; 8x60K, Agilent Technologies). The probes have been filtered and normalized using the BRB ArrayTool Software (v. 4.4.0). The targets were predicted using MiRWalk 2.0 (http//www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/custom.html), in four different algorithms (MiRWalk, RNA22, MiRanda and Targetscan). For the profile analysis between MiRNAs and transcribed coders, 415 samples were obtained from the Cancer Genome Atlas (TCGA) (http//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) and this interaction was subjected to a Pearson correlation test. The MiRNAs differentially expressed in different clinical outcomes were validated by the in situ hybridization (ISH) technique in 114 samples of high-grade serous adenocarcinoma included in the TMA from the Department of Anatomina Patologica A.C.Camargo Hospital and in different samples from the TCGA. The targets of the validated miRNAs were associated with global survival and disease-free in samples of the TCGA and confirmed in samples contained in the TMA of the internal casuistic through the technique of Imunohistoquimica. Results: The comparison analysis between normal control and high degree serous demonstrated that 365 miRNAs were differentially expressed and were found 613 interactions inversely correlated. The MiRNAs mir-934 and mir-143 were associated with worse global survival in our casuistic, the mir-503-5p with chemotherapy resistance. Only the MiR-934 was validated in TCGA and ISH technique. The FZD3 target was predicted for the mir-934 and mir-143 and was negatively correlated with both miRNAs in ovarian tumor cells. The expression of the FZD3 protein by Imunohistoquimica demonstrated that this receptor was not expressed in the cellular membrane but in the cytoplasm and nucleus in the high-degree serous tumors. Conclusion: Several miRNAs have participation in the ovarian tumor progression. The mir-934 was found increased in the metastatic samples and in primary tumors and was associated with worse global survival, as well as the cytoplasmic increase of FZD3, target of the MiR-934, however this was not associated with the expression of Beta-catenin. It is suggested, thus, that other pathways may be involved in this context (AU)