Inmunoensayo multiplex para el diagnóstico simultáneo de diabetes mellitus autoinmune y enfermedad celíaca / Multiplex immunoassay for simultaneous diagnostic of autoimmune diabetes mellitus and celiac disease

RESUMEN

Introducción: la diabetes mellitus autoinmune (DMA) y la enfermedad celíaca (EC) son enfermedades crónicas, poligénicas y multifactoriales vinculadas con la disfunción del sistema inmune. Dado que es frecuente que un mismo paciente presente ambas patologías, la detección simultánea de los marcadores de autoinmunidad de DMA y EC sería una estrategia racional para mejorar el diagnóstico. Objetivos: desarrollar un inmunoensayo basado en citometría de flujo (FloCMIA multiplex) para la detección simultánea y discriminativa de marcadores de DMA (GADA e IA-2A) y de EC (tTgA). Materiales y métodos: las muestras analizadas consistieron en sueros provenientes de 35 individuos controles normales y 21 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (DM1). Se empleó un modelo de "doble paratope" incubando los sueros con una mezcla de microesferas de diferente fluorescencia interna, cada una adsorbida con un autoantígeno TrxGAD, TrxIA-2 o H6-tTg, y una mezcla de dichos autoantígenos biotinilados. Los inmunocomplejos se detectaron con estreptavidina-ficoeritrina y se adquirió en un citómetro de flujo. Resultados: FloCMIA multiplex detectó GADA en el 76,2% de los pacientes e IA-2A en el 52,38% (sensibilidad analítica 88,24 y 56,25% respectivamente,y especificidad 85,71%) y tTgA en el 42,86% (sensibilidad analítica 50,0%, y especificidad 80,0%). Estos resultados se contrastaron con el ensayo de unión de radioligando para GADA e IA-2A y se detectaron 80,95 y 76,19% de los sueros respectivamente (especificidad 100%), y con un ELISA para tTgA se detectó un 38,1% (especificidad 97,1%). Conclusiones: FloCMIA multiplex permitió detectar y discriminar GADA, IA-2A y/o tTgA, -en un único acto analítico- en sueros de pacientes con DMA y/o EC. El novedoso inmunoensayo desarrollado simplifica el screening de la población a gran escala

ABSTRACT

Introduction: autoimmune diabetes mellitus (ADM) and celiac disease (CD) are chronic, polygenic and multifactorial diseases associated with immune system dysfunction. As it is frequent that a patient presents both pathologies, the simultaneous detection of autoimmunity markers of ADM and CD would be a rational strategy to improve the diagnosis. Objectives: to develop an immunoassay based on Flow Cytometry (FloCMIA multiplex) for the simultaneous and discriminative detection of markers for ADM (GADA and IA-2A) and CD (tTgA). Materials and methods: thirty five serum samples of control individuals and 21 type 1 diabetes mellitus (T1DM) patients were assayed. A "double bridge" model was used for the assay, incubating the serum samples with a mixture of microspheres containing different amount of internal fluorescence, each one adsorbed with an autoantigen TrxGAD, TrxIA-2 or H6-tTg, and a mixture of the same biotinilated autoantigens. The immunocomplexes were detected using streptavidinphycoerytrin and then acquired in a flow cytometer. Results: FloCMIA multiplex detected GADA in 76.2% of the patients; IA-2A in 52.38% (analytical sensitivity 88.24% and 56.25% respectively, and specificity 85.71%) and tTgA in 42.86% (analytical sensitivity 50.0%, and specificity 80.0%). These results were compared with the radioligand binding assay for GADA and IA-2A, detecting 80.95% and 76.19% of the serum samples respectively (100% specificity), and with an ELISA for tTgA detecting 38.1% (97.1% specificity). Conclusions: FloCMIA multiplex allowed detecting and discriminating GADA, IA-2A and/or tTgA, -in a single assay- in serum samples of ADM and/or CD. The novel developed immunoassay simplifies the screening of the large scale population