Identificación de Bartonella bacilliformis por métodos moleculares / Bartonella bacilliformis diagnosis by molecular methods

RESUMEN

Introducción: La técnica de PCR amplifica una secuencia de ADN con la enzima polimerasa; es muy sensible y especifica. Objetivo: Estandarizar una técnica de PCR para identificar Bartonella bacilliformis en sangre total de pacientes con bartonelosis aguda. Material y métodos: Se usó muestras de sangre total de seis pacientes con diagnóstico clínico y microbiológico de bartonelosis aguda. Se extrajo el ADN de sangre total usando el detergente guanidina DNAZOL BD. Se amplificó el ADN usando los cebadores de extensión "primers" 16S y 23S del espaciador de trascripción interna (ITS). Se hizo electroforesis de los productos de amplificación en gel de agarosa. Se compararon los pesos moleculares de las bandas observadas en la electroforesis con un marcador de 100 pares de bases. Resultados: Se determinó que la concentración de ADN extraído por DNAZOL BD corresponde alrededor de 6 ng de ADN. El producto amplificado de muestras de sangre total fue alrededor de 1000 pares de bases, idéntico al extraído de los hemocultivos de B. bacilliformis y claramente diferente del de otras especies. Las diluciones de las extracciones mejor detectadas por PCR fueron 1/5 y 1/10. Conclusiones: El ADN de B. bacilliformis extraído con DNAZOL BD de sangre total de pacientes con bartonelosis aguda es amplificado por PCR utilizando los primers 16S y 23S; es posible usar esta técnica para el diagnóstico etiológico rápido.

ABSTRACT

Background: The PCR methodology amplifies a sequence of DNA with the Polimerase enzyme; the sensibility and specificity is very high. Objective: To develop a PCR methodology designed to work on extracts from whole blood samples rather than from isolated, cultured organisms. Methods. The whole blood of six patients with clinical and microbiologic diagnosis of acute bartonelosis by B. bacilliformis was used. The DNA was extracted with DNAZOL® BD (lysis solution with guanidine detergent), and the extract subjected to PCR using primers 16S and 23S for the Intergenic Transcribed Spacer (ITS). The amplified products were subjected to electrophoresis on 1 per cent agarose gels. Results: The concentration of the extracted product with DNAZOL® BD was around 6 ng. The amplified single sized product of 1000 base pairs was identical to that from authentic cultures of B. bacilliformis and clearly different from that of other species. The dilutions detected by PCR were 1/5 and 1/10. Conclusion: The amplification of the DNA of B. bacilliformis extracted with DNAZOL® BD from whole blood of patients with acute bartonelosis using the primers 16S and 23S is possible using this method for a fast etiologic diagnosis. ( Rev Med Hered 2002; 13 58-63 ).