Modified comet assay with Giemsa staining: a suitable method for assessing genotoxicity in rats / Ensaio cometa modificado com coloração de Giemsa: um método adequado para avaliar a genotoxicidade em ratos

ABSTRACT

The present study tested a comet assay that was modified for compatibility with Giemsa staining to assess the drug genotoxicity in the peripheral blood of rats. We analysed the peripheral blood of 16 female Wistar rats (N=8 rats/group) from a control group and from a group that was treated with an intraperitoneal injection of 50mg cyclophosphamide/kg. The comet assay was carried out with modifications of the blood volume and immersion time in the lysing solution and different combinations of electrophoresis conditions (running time, voltage and current), to Giemsa staining. The lysing time and electrophoresis conditions allowed for the expression of all classes of DNA damage during the electrophoresis run, and the comets were efficiently stained with Giemsa. The technique showed high reproducibility for the DNA classes. The results demonstrate that the modified comet assay with Giemsa staining can be standardized for routine laboratory procedures using a 20µL blood sample, 3h and 30min immersions in the lysing solution and electrophoresis runs with 23 to 25 V and 310 and 360mA of electrical current. The modified comet assay with Giemsa staining that was described in the present study was standardized to be applied in the laboratory routine.(AU)

RESUMO

O presente estudo testou um ensaio cometa modificado para a coloração de Giemsa para avaliar a genotoxicidade de fármacos no sangue periférico de ratos. Analisou-se o sangue periférico de 16 ratas Wistar (n=8 ratas/grupo) de um grupo controle e de um grupo que foi tratado com uma injeção intraperitoneal de 50mg/kg pv. de ciclofosfamida. O ensaio cometa foi realizado com modificações do volume sanguíneo e do tempo de imersão na solução de lise, bem como com diferentes combinações de condições de eletroforese (tempo de corrida, tensão e corrente), para coloração de Giemsa. O tempo de lise e as condições de eletroforese permitiram a expressão de todas as classes de danos no DNA durante a corrida de eletroforese, e os cometas foram eficientemente corados com Giemsa. A técnica mostrou alta reprodutibilidade para as classes de DNA. Os resultados demonstram que o ensaio cometa modificado com coloração de Giemsa foi padronizado para procedimentos laboratoriais de rotina usando-se uma amostra de sangue de 20µL, 3h30min de imersão na solução de lise e eletroforese com 23 a 25 V e 310 e 360mA. O ensaio cometa modificado com coloração de Giemsa descrito foi padronizado para ser aplicado na rotina laboratorial.(AU)