Avaliação da via do c-kit no adenoma pleomórfico e carcinoma adenoide cístico das glândulas salivares: estudo da expressão das proteínas da via, das mutações e da regulação pós-transcricional do gene kit / c-Kit signaling cascade in pleomorphic adenoma and adenoid cystic carcinoma of salivary glands: evaluation of cascade proteins, mutations and post-transcriptional regulation of gene Kit

RESUMO

Introdução: As neoplasias das glândulas salivares têm amplo espectro histológico resultante da múltipla diferenciação celular tumoral. O adenoma pleomórfico (AP) e o carcinoma adenoide cístico (CAC) são as mais comuns neoplasias benignas e malignas provenientes do ducto intercalado, respectivamente, além de serem compostas por estruturas luminais e células mioepiteliais. Em estudo realizado previamente pelo nosso grupo, detectamos que a proteína c-kit está envolvida nos processos da morfogênese das glândulas salivares e no adenoma pleomórfico. A proteína c-Kit tem papel importante no desenvolvimento de muitos processos embrionários, incluindo a gametogênese, melanogênese e hematopoiese, e também na biologia de tumores. Sua ativação induz diversas respostas intracelulares através de cascatas de sinalização de vias como PI3K/AKT e MAPK. Em tumores da glândula salivar ainda há poucos estudos sobre as alterações do gene KIT e das proteínas relacionadas a sua via de sinalização, assim como sua regulação pós-transcricional, realizada principalmente por meio dos microRNAs. O presente estudo avaliou, em APs e CACs (a) a localização das proteínas das vias PI3K/AKT/mTOR e MAPK por meio da técnica de imunoistoquímica; (b) a expressão dos microRNAs 221 e 222, relacionados ao gene KIT (c) a associação dos achados laboratoriais com variáveis clínicas, patológicas e sobrevida. Resultados: Nos casos de AP a proteína c-Kit foi identificada em formações luminais e em raras células isoladas no parênquima tumoral. Já nos CAC, observou-se positividade na membrana das células ductais. Para a via de PI3K/AKT/mTOR, no AP, a proteína PI3K beta mostrou-se parcialmente positiva no citoplasma das células próximas à capsula tumoral, e as proteínas AKT e mTOR fosforiladas, foram expressas especialmente nas células epiteliais e em poucas células mioepiteliais. Já no CAC, a proteína PI3K beta e AKT fosforilada mostraram-se negativas na maioria dos casos, e a proteína mTOR fosforilada foi expressa no citoplasma das células epiteliais e em algumas células mioepiteliais. Para a via MAPK, as proteínas RAS, MEK-1 fosforilada e ERK 1/2 foram negativas na maioria dos AP e CAC; B-Raf e MEK-2 fosforilada foram observadas nas células luminais dos AP. Nos CAC, estruturas luminais neoplásicas foram positivas para a proteína MEK-2 fosforilada; B-Raf foi positivo nas células luminais e mioepiteliais. Além disso, os pacientes que expressaram as proteínas mTOR e MEK-2 fosforilada apresentaram sobrevida câncer-específica significativamente aumentada (p=0,040 e p=0,005, respectivamente). Na análise do microRNAs, a expressão do miR-221 foi variável nas 13 amostras analisadas, tendo baixa expressão em 30,77% dos casos, expressão normal em 38,46 e expressão aumentada em 30,77% dos casos. Já nos APs o miR-221 foi detectado em 19 amostras, sendo 36,84% com baixa expressão, 52,63% com expressão normal e expressão aumentada foi vista em 10,53% dos casos. A expressão do miR-222 foi detectada em 14 CACs, sendo que a maioria dos casos (8 casos ­ 57,1%) a expressão do miR-222 foi semelhante ao observado nas amostras não neoplásicas. Nos APs, o miR-222 foi detectado em 22 amostras, sendo 31,8% com baixa expressão, 31,8% com expressão normal e 36,4% com expressão aumentada. Conclusão: Apesar de a proteína c-Kit ser expressa em ambas as neoplasias ­ AP e CAC, sua influência sobre as vias de sinalização MAPK e PI3K/AKT/mTOR ainda permanece por ser estabelecida. Ainda, os microRNAs 221 e 222 não mostram correlação consistente com a expressão de c-Kit nos tipos tumorais estudados.

ABSTRACT

Introduction: Salivary gland tumors present broad histological spectrum resulting from multiple tumor cell differentiation. Pleomorphic adenoma (PA) and adenoid cystic carcinoma (ACC) are the commonest benign and malignant salivary gland neoplasms originated from the intercalated duct region, respectively, and are composed by luminal structures and myoepithelial cells. In a previous study we detected that protein c-kit is involved in the process of salivary gland morphogenesis and PA. c-Kit protein is important during embryogenesis, including gametogenesis, melanogeneis and hematopoiesis as well as in tumorigenesis. Its activation induces various intracellular responses through pathways such as MAPK and PI3K/AKT/mTOR signaling cascades. In salivary gland neoplasms, only a few reports have shown that alterations in KIT gene are present and proteins related to its signaling pathway as well as its post-transcriptional regulation. This study has aimed at evaluating in PA and ACC (a) the proteins location of PI3K/AKT/mTOR and MAPK pathways using immunohistochemistry (IHC); (b) expression of miR-221 and miR-222, related to KIT gene; and (c) the association of these findings with clinical, pathological and survival data of patients. Results: In PA c-kit was positive in isolated luminal cells; in ACC, neoplastic luminal structures were positive for c-Kit. In PA, PI3K beta protein was shown to be partially positive in the cytoplasm of cells near the tumor capsule and phosphor AKT and phospho mTOR, are specifically expressed in epithelial cells and in a few myoepithelial. In ACC, PI3K and phosphor AKT protein showed to be negative in most of cases. Phospho mTOR protein was expressed in the cytoplasm of epithelial cells and some myoepithelial cells. In MAPK pathway, Ras, ERK1/2 and phosphor MEK-1 proteins were negative in most PAs and CACs; B-Raf and phospho MEK-2 were detected in luminal cells of PA. In ACC neoplastic luminal structures were positive for phospho MEK-2; B-Raf was also positive in myoepithelial and epithelial cells. In addition, cases with expressed phospho-mTOR and phosphor MEK-2 proteins were significantly associated with higher cancer-specific survival (p = 0.040 and p = 0.005, respectively). Moreover, expression of miR-221 was detected in 13 CAC samples and 19 PA samples. In CAC, expression of miR-221 was downregulated in 30,77% of the samples, upregulated in 30,77% samples, and normal in 38,46% samples. In PA, miR-221 expression was downregulated in 36,84% samples, upregulated in 10,53% samples, and normal in 52,63% samples. Expression of miR-222 was detected in 14 CAC samples and 22 PA samples. In the majority of CAC samples, the expression of miR-222 was similar to that observed in non-neoplastic samples. In PA samples, expression of miR-222 was downregulated in 31,8% samples, upregulated in 36,4% samples, and normal in 31,8% samples. Conclusion: Although c-Kit expression is detected in PA and ACC, its influence on the MAPK e PI3K/AKT/mTOR signaling cascades remains to be established. miR-221 e -222 did not show a robust correlation with c-Kit expression in the tumors studied.