Papel da Stress Inducible Phosphoprotein One (STI1) e da proteína prion celular na angiogênese tumoral / The role of Stress Inducible Phosphoprotein One (STI1) and cellular prion protein in tumor angiogenesis

RESUMO

Proteínas multifuncionais podem ser consideradas uma vantagem evolutiva celular, ao passo que uma única proteína divide-se, simultaneamente, entre suas funções intracelulares e a sinalização extracelular para complementar mecanismos de responsividade tecidual. No papel de co-chaperona, a STI1 se complexa com HSP70/90, auxiliando no dobramento de proteínas. Reciprocamente, a secreção não convencional da STI1, em geral associada a vesículas extracelulares, permite a sua integração dinâmica com a demanda fisiológica pelas suas funções neurotróficas, ou até vasculogênicas, pelo recrutamento de precursores endoteliais para a regeneração do tecido cerebral durante a isquemia, sendo ambas mediadas via receptor PrPC (proteína príon). Em glioblastomas, a sinalização via STI1-PrPC também se mostrou determinante para a progressão tumoral. Dessa maneira, a STI1 apresenta um grande potencial de estudo como agente regulador dos processos angiogênicos tumorais em glioblastomas. As funções da STI1 foram avaliadas no modelo de glioma murino GL261 in vitro, ex vivo e in vivo em relação à invasão perivascular e à angiogênese peritumoral. A secreção de STI1 pelas células GL261 ocorre de maneira abundante, em sua maior parte na forma solúvel, não associada a vesículas extracelulares, por mecanismos ainda a serem desvendados, mas não controlados por hipóxia. O papel da STI1 no estímulo à giogênese sobre células endoteliais foi verificado em ensaios de formação de tubos (2D) e microvasos (3D) e em anéis aórticos. Porém, a contaminação por LPS nas preparações bacterianas de STI1 recombinante tornou inválidos nossos esforços e os ensaios foram interrompidos. Os ensaios in vivo foram realizados por meio da injeção intracerebral (ortotópica) de células GL261 em animais tipo-selvagem, haploinsuficientes (STI1+/-) e superexpressores de STI1 (TgA). A sobrevida dos animais STI1+/- e TgA foi estatisticamente superior a dos animais tipo-selvagem. Imunofluorescências com o marcador de células endoteliais CD31 indicaram uma maior vascularização intratumoral nos animais STI1+/-, enquanto animais TgA apresentaram marcação menor que animais tipo-selvagem. Tratamentos com anticorpos neutralizantes para STI1, da mesma forma que implantes ortotópicos de GL261 em animais deficientes para PrPC (PrP0/0), não produziram alterações no crescimento tumoral, que apresentou o mesmo padrão de invasão perivascular e de angiogênese peritumoral. A ausência de resposta também se reproduziu nos ensaios ex vivo dos tumores de GL261, a partir de co-culturas organotípicas com fatias de cérebros de animais STI1+/- e PrP0/0, em relação aos animais tipo-selvagem. Como abordagem final, as células GL261, previamente silenciadas para a expressão de STI1 ou HIF-1α, foram implantadas ortotopicamente no cérebro de animais tipo-selvagem. Apesar de terem sido selecionados os clones com menor nível de expressão de cada proteína, novamente não se verificaram alterações do crescimento tumoral e da angiogênese. Em conjunto, os resultados indicam que a proteína STI1 não possui efeito sobre o crescimento dos tumores de GL261, especialmente no que diz respeito à invasão perivascular e a vascularização intra/peritumoral. Linhagens celulares, porém, como a GL261, podem perder sua assinatura genética pela pressão seletiva a que são submetidas durante o seu período em cultura, o que compromete a sua representatividade in vivo em relação ao fenótipo tumoral infiltrativo próprio dos gliomas. A função extracelular de STI1 como modulador da angiogênese sobre células endoteliais ainda pode ser determinada com a utilização de proteína recombinante livre de LPS, ou sendo esta produzida por sistema heterólogo não-bacteriano

ABSTRACT

Multifunctional proteins might provide cells with an evolutionary advantage since a sole protein engages in concerted mechanisms of tissue responsiveness by simultaneously acting as a mediator of complementary intracellular and extracellular signaling pathways. Intracellularly, the cochaperone STI1 is an adaptor protein that aids in the folding of client proteins through the HSP90/70 complex. Conversely, the availability of cellular stocks of STI1 enables its dynamic mobilization by unconventional secretion, mostly associated with extracellular vesicles, in order to meet physiological demands extracellularly. Originally described as a neurotrophic growth factor, STI1 also holds vasculogenic functions, given the recruitment of endothelial progenitor cells positive for PrPC (prion protein) receptors from bone marrow to ischemic regions of mice brain, where it prompts vascular and functional recovery. In glioblastomas, signaling via STI1-PrPC axis was also showed to govern tumor progression. Thus, STI1 represents a potential target for modulation of tumor angiogenesis in glioblastomas (GBMs). We used the GL261 murine GBM cell line as an in vitro, ex vivo and in vivo model to evaluate the role of STI1 in certain aspects of perivascular invasion and peritumoral angiogenesis. GL261 cells secrete large amounts of freely soluble STI1, which is not influenced by hypoxia, and a small proportion associated to extracellular vesicles, in agreement with previously studied human GBM cell lines, although the mechanism for this protein segregation is still unknown. Recombinant STI1 apparently stimulated the endothelial sprouting as verified in 2D and 3D in vitro assays (matrigel tube formation and microcarrier-based microvessels formation), besides 3D ex vivo aortic ring assays. However, during these experiments, we found our recombinant protein with a high level of LPS contamination, due to failures in the established purification techniques used to process our bacterial preparations, which prevented the confirmation of STI1 as a pro-angiogenic factor. Orthotopic tumors were obtained by intracerebral injection of GL261 cells in wild-type, superexpressing STI1 (TgA) and haploinsufficient for STI1 (STI1+/-) C57BL/6J mice. Survival of STI1+/-and TgA mice was statistically higher compared to wild-type ones. Immunofluorescence staining of brain tissue sections with the endothelial cell marker CD31 revealed enhanced intratumoral vascularization, related to the wild-type controls, in STI1+/- mice, whereas TgAs presented as the least vascularized. Despite variations in intratumoral vascularization, tumor growth remained encapsulated within the brain parenchyma, without the typical difuse infiltration of GBMs associated with peritumoral angiogenesis. Even when tumors in wild-type mice were treated with neutralizing antibody for STI1, or GL261 cells were orthotopically implanted in PrP0/0 mice brains, tumor histology remained the same, reproducing results from organotypic co-cultures of wild-type, STI1+/-and PrP0/0 mice brain slices with GL261 tumors ex vivo. Unexpectedely, the highest knockdown of STI1 or HIF-1α obtained by lentiviral transduction in selected GL261 cell clones equally produced no effect over orthotopic tumor growth, perivascular invasion, and both intratumoral and peritumoral angiogenesis in wild-type mice brains. Taken together, our results show that STI1 might not affect GL261 tumor growth, and also raises conceptual caveats to the experimental utility of cancer cell lines as an in vivo representative of tumor phenotype. Future experiments might reveal the true angiogenic potential of LPS-free recombinant STI1 produced by a nonbacterial heterologous system