Papel das vesículas extracelulares secretadas por adenocarcinomas gástricos na resposta ao tratamento quimioterápico / Role of extracellular vesicles secreted by gastric adenocarcinomas in response to chemotherapy

RESUMO

O adenocarcinoma gástrico (AdG) é a terceira causa mais comum de morte por câncer no mundo e um dos tumores com maior índice de mortalidade no Brasil. Estes tumores aparecem em terceiro lugar na incidência entre homens e em quinto nas mulheres. A quimioterapia neoadjuvante (QT) com 5-fluorouracil (5-FU) pode melhorar a ressecabilidade e a sobrevida dos pacientes com AdG, porém sua eficácia está limitada pela resistência à droga. Apenas pacientes que respondem a esta terapia com toxicidade tolerável são potencialmente beneficiados, entretanto não é possível identificar e separar clinicamente estes indivíduos. Assim, identificar marcadores preditivos de resposta para selecionar os pacientes que se beneficiariam deste tratamento é relevante. Vesículas extracelulares (VEs) são componentes secretados pelas células incluindo células tumorais, cujo conteúdo é regulado e composto por moléculas que podem ter uma miríade de funções locais e a distância. Muitas destas moléculas podem ser também usadas como biomarcadores séricos por conterem informações importantes sobre o tumor. Desta forma, este trabalho tem como objetivo identificar marcadores de resistência a 5-FU em VEs secretadas por linhagens celulares humanas de câncer gástrico e avaliar o papel das VEs na quimioresistência. Para tanto, foram geradas células de AdG derivadas da linhagem AGS, resistentes a 5-FU (rAGS_FU) de onde foram isoladas, quantificadas e caracterizadas VEs. Células rAGS-FU secretam cerca de 2 vezes mais VEs que as células parentais (AGS), entretanto a distribuição destas por tamanho é semelhante. As células rAGS_FU apresentaram maior proliferação, capacidade de formação de colônias e invasão que as células AGS. Interessantemente, as VEs provenientes de células resistentes a 5-FU, rAGS_FU, são capazes de transferir à células AGS os fenótipos de resistência ao quimioterápico bem como um aumento na capacidade de formação de colônias e invasão. As células AGS que se tornam resistentes ao tratamento não têm este fenótipo revertido pela remoção das VEs da células resistentes nem pelo tratamento com VEs de células AGS parental, indicando que o fenótipo de resistência adquirido após o tratamento é irreversível, pelo menos pelo período estudado. O conteúdo proteico das VEs das células AGS e rAGS_FU e suas respectivas VEs foi comparado por proteômica. Nessa abordagem foram identificadas 1.915 proteínas nas células e 1.638 proteínas em VEs das quais 309 proteínas eram diferencialmente expressas em células e 66 em VEs. Entre as proteínas com expressão diferencial entre as duas células e também nas suas respectivas VEs, selecionamos e validamos por western blotting a proteina fascina. Esta parece ser um potencial candidato a biomarcador de resistência a 5-FU uma vez que sua expressão é indetectável na célula AGC e suas VEs e altamente expressa nas células rAGS_FU e suas vesículas. A fascina é uma proteína do citoesqueleto com um papel chave nas interações célula-célula, adesão e motilidade celulares e é associada a agressividade tumoral. Estes dados apontam o papel das VEs nos mecanismos relacionados à resistência a 5-FU em células de AdG e sugerem que fascina possa estar associada ao mecanismo de resistência a este quimioterápico e que também seja um potencial biomarcador deste fenótipo

ABSTRACT

Gastric adenocarcinoma (GAd) is the third most common cause of cancer related death worldwide, and one of the tumors with the highest mortality rates in Brazil. In men, this cancer ranks the third most common cancer, while in women, it ranks fifth. 5-fluorouracil (5-FU) based neoadjuvant chemotherapy can improve tumor resectability and patient's survival rates. Its effectiveness however, is limited by drug resistance. Thus, an effort to identify predictive markers of response to neoadjuvant therapy and select patients who could benefit from this treatment is relevant. One such approach could be to use contents of extracellular vesicles (EVs). EVs are components secreted by cells including tumor cells, whose contents are composed of molecules that can have a myriad of local and distance functions and many of these molecules can also be used as serum biomarkers since they contain important information about the tumor. This work aims to identify 5-FU resistance markers in EVs secreted by human gastric cancer cell line and to evaluate the role of EVs in chemoresistance. GAd cells resistant to 5-FU (rAGS_FU) were generated from the AGS cell line and EVs secreted by rAGS_FU cells and parental AGS cells were isolated, quantified and characterized. Our results showed that AGS_FU cells secrete about 2 times more EVs than parental AGS cells, however their size distribution is similar. The resistant rAGS_FU cells showed higher proliferation rates, capacity of colony formation and invasion properties. Interestingly, EVs from 5-FU resistant cells, rAGS_FU, are able to transfer to the AGS cells the phenotypes of resistance to chemotherapy as well as an increase in the capacity of colony formation and invasion. AGS cells that become resistant to treatment do not have this phenotype reversed by removal of the EVs from the resistant cells or by treatment with EVs from parental AGS cells, indicating that the resistance phenotype acquired after treatment is irreversible, at least for the period studied. The protein content of the AGS and rAGS_FU cells and their respective EVs was compared by proteomics. In this approach, 1,915 proteins were identified in cells and 1,638 proteins in EVs of which 309 proteins were differentially expressed in cells and 66 in EVs. Among the proteins with differential expression between the two cells and also in their respective EVs, we selected and validated by western blotting the protein fascin. Fascin protein appears to be a potential candidate for biomarker of 5-FU resistance since its expression is undetectable in AGS cells and their EVs and highly expressed in rAGS_FU cells and their vesicles. Fascin is a cytoskeletal protein with a key role in cellcell interactions, cell adhesion and motility and is associated with tumor aggressiveness. These data point to the role of EVs in the mechanisms related to 5-FU resistance in GAd cells and suggest that fascin may be associated with the mechanism of resistance to this chemotherapeutic agent and that it is also a potential biomarker of this phenotype