Efeitos do extrato aquoso de guaraná (Paullinia cupana) em pó nos mecanismos envolvidos com a absorção de colesterol in vitro e em células Caco-2 / Effects of the aqueous extract of guarana (Paullinia cupana) powder on the mechanisms involved with the absorption of cholesterol in vitro and in Caco-2 cells

RESUMO

Introdução - O risco de doenças cardiovasculares, dentre elas a aterosclerose, está associado com a hipercolesterolemia, resultado de fatores de risco comportamentais, metabólicos e genéticos. Intervenções dietéticas como o uso do guaraná (Paullinia cupana), podem ser úteis, uma vez que é um alimento rico em compostos bioativos como as catequinas, que possuem elevada atividade antioxidante, inibem a oxidação da lipoproteína de densidade baixa (LDL) e a peroxidação lipídica, sendo capazes de reduzir a concentração plasmática de colesterol, por mecanismos ainda não totalmente elucidados. Objetivo - Investigar os efeitos do extrato aquoso de guaraná (Paullinia cupana) em pó sobre mecanismos envolvidos com a absorção de colesterol em modelos in vitro e em células Caco-2. Métodos - O extrato aquoso do guaraná em pó foi submetido à digestão in vitro, os fenólicos totais foram quantificados pelo método de Folin-Ciocalteu e a determinação do perfil de fenólicos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com detector UV/VIS a 210 nm. A atividade antioxidante foi determinada pela capacidade de absorbância de radical oxigênio (Oxygen Radical Absorbance Capacity - ORAC) e foram avaliadas a capacidade de inibição da lipase pancreática, de ligação com ácidos biliares, de interação com a fosfatidilcolina micelar e de inibição da solubilização micelar do colesterol de forma in vitro. Foi realizado ensaio de permeação do colesterol por um período de 2 h em células Caco-2 semeadas e diferenciadas em placas transwell de 24 poços com uma solução de micelas de colesterol e extrato de guaraná em diferentes concentrações. O teor de colesterol permeado foi determinado por HPLC/UV a 206 nm. Foi realizado o ensaio de Western blotting para determinar o conteúdo proteico dos transportadores de colesterol (NPC1L1, ABCG5, ABCG8) e LXR-alfa em células intestinais Caco-2 após a incubação com diferentes concentrações do extrato em 2 e 16 horas. Resultados: O conteúdo total de fenólicos do extrato de guaraná foi 104,36 (± 3,62) mg EAG/g de guaraná em pó. Após o processo de digestão, este valor foi de 48,62 (± 3,97) mg EAG/g de guaraná em pó, demonstrando a bioacessibilidade dos polifenóis. Foram identificados os compostos procianidina B1 (1,56 ± 0,04 mg/g) e B2 (2,34 ± 0,06 mg/g), catequina (24,26 ± 0,63 mg/g), epicatequina (20,39 ± 1,20 mg/g) e cafeína (34,93 ± 0,75 mg/g) no extrato não digerido. Após digestão in vitro, somente a catequina, epicatequina e cafeína foram bioacessíveis com 181,16 %, 136,78 % e 213,51 % de bioacessibilidade, respectivamente. A atividade antioxidante do extrato aquoso não digerido foi menor que do digerido, sendo os valores finais de ORAC de 2512 (± 399) e 4321 (± 778) µmol Eq Trolox/g de guaraná em pó, respectivamente. O extrato exibiu uma atividade inibitória da enzima lipase pancreática de forma dose-dependente, com IC50 de 1033 µg/mL. O extrato também demonstrou uma capacidade de ligação ao taurocolato de sódio de 45,63 (± 8,50) % e de 44,30 (± 8,88) % com concentrações de 1,0 mg/mL e 0,5 mg/mL, respectivamente, correspondendo a 71,78 (± 13,36) % e 93,11 (± 18,65) % da capacidade de ligação da colestiramina quando utilizada nas mesmas concentrações. Observou-se uma redução de 20,47 (± 10,24) % e 17,06 (± 12,88) % na concentração da fosfatidilcolina micelar quando o guaraná foi utilizado nas concentrações de 1,0 e 0,50 mg/mL, respectivamente, em comparação com a micela padrão sem amostra e uma inibição da solubilização micelar do colesterol de 10,14 % pelo guaraná a 1,0 mg/mL. Após o experimento de permeação, as concentrações de colesterol no compartimento basolateral foram de 197,89 (± 3,95), 151,76 (± 1,39) e 94,51 (± 9,49) µg/mL, quando 0,025, 0,050 ou 0,075 mg/mL de guaraná foram utilizados, respectivamente, demonstrando redução de 23,31 % e 52,24 % à medida que a concentração de guaraná utilizada aumentou. Observou-se uma redução do conteúdo proteico do NPC1L1 após 16 horas de incubação com guaraná nas concentrações de 0,050 e 0,075 mg/mL. Em relação ao ABCG5, observou-se um aumento do conteúdo nas concentrações de 0,025 e 0,075 mg/mL de guaraná após 02 horas. Não foram observadas diferenças importantes nos conteúdos de ABCG8 e do LXR-alfa. Conclusões: O extrato aquoso de guaraná em pó demonstrou uma redução da absorção de colesterol em células Caco-2. O extrato também demonstrou uma atividade inibitória da lipase pancreática dose-dependente, uma boa capacidade de ligação aos ácidos biliares e de interação com a fosfatidilcolina micelar, além de uma capacidade de inibição da solubilização micelar do colesterol de forma in vitro. O extrato também foi capaz de modular negativamente o conteúdo proteico do NPC1L1 e positivamente o conteúdo do ABCG5. A sua ingestão pode ser considerada uma importante fonte alimentar com potencial efeito hipocolesterolêmico, capaz de reduzir a absorção de lipídios no intestino, podendo ser utilizado como adjuvante na regulação da hipercolesterolemia, provavelmente devido à presença de polifenóis.

ABSTRACT

Introduction - The risk of cardiovascular diseases, such as atherosclerosis, is associated with hypercholesterolemia, a result of behavioral and metabolic risk factors. Dietary interventions with the use of guarana (Paullinia cupana) may be useful, since it is a food rich in bioactive compounds such as catechins, which have high antioxidant activity, inhibit oxidation of LDLc and lipid peroxidation, being able to lower blood cholesterol levels, by mechanisms not yet fully elucidated. Objective - To investigate the effects of guarana (Paullinia cupana) powder aqueous extract on mechanisms involved with the absorption of cholesterol in vitro and in Caco-2 cells. Methods - The guarana powder aqueous extract was subjected to in vitro digestion, the total phenolics content were quantified by the Folin-Ciocalteu method and the determination of the phenolic profile was performed by high performance liquid chromatography (HPLC) UV/VIS at 210 nm. The antioxidant activity was determined by Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and the ability to inhibit pancreatic lipase, to binding with bile acids, the interaction with micellar phosphatidylcholine and the inhibition of micellar solubilization of cholesterol in vitro were evaluated. Cholesterol permeation assay was performed for a period of 2 hours in Caco-2 cells seeded and differentiated in 24- transwell plates with a solution of cholesterol micelles and guarana extract at different concentrations. The permeated cholesterol content was determined by HPLC/UV at 206 nm. The Western blotting assay was performed to determine the protein content of cholesterol transporters (NPC1L1, ABCG5, ABCG8) and LXR-alpha in Caco-2 cells after incubation with different concentrations of the extract in 2 and 16 hours. Results: The total phenolic content of the guarana extract was 104.36 (± 3.62) mg EAG/g of guarana powder. After the digestion process, this value was 48.62 (± 3.97) mg EAG/g of guarana powder, demonstrating the bioaccessibility of the polyphenols. Procyanidin B1 (1.56 ± 0.04 mg/g) and B2 (2.34 ± 0.06 mg/g), catechin (24.26 ± 0.63 mg/g), epicatechin (20.39 ± 1.20 mg/g) and caffeine (34.93 ± 0.75 mg/g) were identified in the undigested extract. After in vitro digestion, only catechin, epicatechin and caffeine were bioaccessible with 181.16 %, 136.78 % and 213.51 % of bioaccessibility, respectively. The antioxidant activity of the undigested aqueous extract was lower than that digested, with the final ORAC values of 2512 (± 399) and 4321 (± 778) µmol Eq Trolox/g of guarana powder. The extract exhibited an inhibitory activity of the pancreatic lipase enzyme in a dose-dependent manner, with an IC50 of 1033 µg/mL. The extract also demonstrated a sodium taurocholate binding capacity of 45.63 (± 8.50) % and 44.30 (± 8.88) % with concentrations of 1.0 mg/mL and 0.5 mg/mL, respectively, corresponding to 71.78 (± 13.36)% and 93.11 (± 18.65)% of the cholestyramine binding capacity when used at the same concentrations. A reduction of 20.47 (± 10.24) % and 17.06 (± 12.88) % was observed in the concentration of micellar phosphatidylcholine when guarana was used at concentrations of 1.0 and 0.50 mg/mL, respectively, compared to the standard micelle without sample and an inhibition of 10.14 % micellar cholesterol solubilization by guarana at 1.0 mg/mL. After the permeation experiment, the cholesterol concentrations in the basolateral compartment were 197.89 (± 3.95), 151.76 (± 1.39) and 94.51 (± 9.49) µg/mL, when 0.025, 0.050 or 0.075 mg/mL of guarana were used, respectively, showing a reduction of 23.31 % and 52.24 % as the concentration of guarana used increased. A reduction in the protein content of NPC1L1 was observed after 16 hours of incubation with guarana at concentrations of 0.050 and 0.075 mg/mL. After 02 hours, an increase in the content of ABCG5 at concentrations of 0.025 and 0.075 mg/mL of guarana was observed. No significant differences were observed in the contents of ABCG8 and LXR-α. Conclusions: The aqueous extract of guarana powder showed a reduction in the absorption of cholesterol in Caco-2 cells. The extract also demonstrated a dose-dependent pancreatic lipase inhibitory activity, a good ability to bind bile acids and to interact with micellar phosphatidylcholine, in addition to an ability to inhibit micellar solubilization of cholesterol in vitro. The extract was also able to negatively modulate the protein content of NPC1L1 and positively the content of ABCG5. Its intake can be considered an important dietary source with a potential hypocholesterolemic effect, capable of reducing the absorption of lipids in the intestine, and can be used as an adjunct in the control of hypercholesterolemia, probably due to the presence of polyphenols.