Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus

RESUMEN

Resumen En un estudio epidemiológico realizado previamente en Argentina, se analizó la secuencia de un fragmento del gen US5 del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), lo que permitió diferenciar las cepas de campo de las vacunales. También esto permitió definir cinco haplotipos del ILTV, con variaciones específicas en las posiciones 461, 484, 832, 878 y 894 del gen US5. La caracterización de las cepas virales también puede lograrse mediante el análisis de la disociación de alta resolución o high-resolution melting analysis (HRMA), descripto como un método efectivo, rápido y sensible para detectar mutaciones en productos de PCR. En el presente estudio se desarrolló un protocolo de disociación de alta resolución con el objetivo de caracterizar cepas del ILTV circulantes en Argentina. Para ello,se confirmó la especificidad de esta herramienta en diferentes diluyentes del ADN de las muestras, sin observarse interferencias en presencia de ADN heterólogo u otros metabolitos celulares. Asimismo, la concentración de sales en el buffer de elución utilizado durante la extracción de ADN no alteró los perfiles de las curvas. Se obtuvieron perfiles bien definidos con concentraciones de ADN más elevadas (Ct = 26.0), mientras que concentraciones más bajas presentaron curvas heterogéneas (Ct = 32.5). El HRMA mostró una concordancia del 97.49% con la técnica de referencia, la secuenciación. El protocolo de disociación de alta resolución amplifica el ADN antes de su caracterización, por lo que esta técnica podría ser eventualmente utilizada para confirmar la presencia del ILTV y, al mismo tiempo, distinguir haplotipos, optimizando su valor como herramienta de diagnóstico. Esta característica implica una reducción significativa en el tiempo dedicado al procesamiento de muestras.