Modelagem celular in vitro da Doença de Huntington com ácido 3-nitropropiônico e ácido quinolínico & Avaliação das funções neuroprotetoras da adenosina / In vitro cell modeling of Huntington's Disease with 3-nitropropionic acid and quinolinic acid and evaluation of the neuroprotective functions of adenosine

RESUMO

A Doença de Huntington (Huntington's disease - HD) trata-se de uma patologia neurodegenerativa hereditária caracteriza por meio da expressão das proteínas huntingtinas mutantes (mHtt), das mortes dos neurônios espinhais médios (medium spiny neurons MSNs) GABAérgicos D2-positivos do striatum e da hipercinesia. Uma hipótese se refere à função das mHtts de potencializarem os efeitos excitotóxicos das estimulações dos receptores de NMDA (NMDAR) por meio da inibição da succinato desidrogenase, resultando em desequilibrio das [Ca2+]i, estresse oxidativo e apoptose. A adenosina agonista dos receptores purinérgicos P1 tem sido descrita por conta das suas funções neuroprotetoras e neuromodulatórias. Assim, estabelecemos dois modelos in vitro da HD fundamentados nas neurodiferenciações das linhagens murinas de célula-tronco embrionárias E14-TG2a e progenitoras neurais do hipocampo HT-22; seguidas pelos tratamentos com ácido quinolínico (QA) agonista seletivo dos NMDARs , na ausência e na presença do ácido 3-nitropropiônico (3-NP) inibidor irreversível da succinato desidrogenase. Estes modelos foram utilizados nas avaliações das funções neuroprotetoras da adenosina. Os neurônios pós-mitóticos das culturas de E14-TG2a diferenciadas foram caracterizados conforme os MSNs GABAérgicos do striatum; enquanto os neurônios HT-22 diferenciados foram caracterizados de modo inespecífico. Metodologia: imunofluorescência (microscopia e citometria); PCR em tempo real; análise das variações dos potenciais das membranas plasmáticas e das variações transientes das [Ca2+]i por microfluorimetria; e quantificações das reduções do AlamarBlue® (% de sobrevida celular) e das atividades extracelulares de LDH (U/L) (necrose) por espectrometria. Avaliamos a capacidade do 3-NP de potencializar os efeitos excitotóxicos do QA comparando dois grupos de neurônios HT-22 diferenciados QA 8mM (EC50) (controle); e 3-NP 5mM/QA 8mM. Avaliarmos o potencial neuroprotetor da adenosina comparando quatro grupos de neurônios HT-22 diferenciados QA 8mM; adenosina 250µM/QA 8mM; 3-NP 5mM/QA 8mM; 3-NP 5mM/adenosina 250µM/QA 8mM. Os neurônios pós-mitóticos derivados das E14TG2a foram classificados como MSNsGABAérgicos do striatum integrantes de uma cultura neuronal heterogênea semelhante às conexões nigroestriatais, corticoestriatais, striatonigral e striatopallidal. Os neurônios HT-22 diferenciados perfaziam uma cultura neuronal heterogênea, não totalmente madura, composta por neurônios glutamatérgicos, dopaminérgicos, colinérgicos e GABAérgicos. Os neurônios HT-22 diferenciados 3-NP 5mM apresentaram menores % de sobrevida celular após os tratamentos com QA 8mM por 24h (p<0.05); e maiores amplitudes das variações das [Ca2+]i dependentes do QA 8mM (p<0.05) (cinética 6 minutos). Por outro lado, os neurônios HT-22 diferenciados pré- tratados com 3-NP 5mM apresentaram menores atividades extracelulares de LDH após o tratamento com QA 8mM por 24h menor proporção de necrose. Os pré-tratamentos com adenosina 250µM indicaram uma tendência dos efeitos neuroprotetores (p>0.05) maiores % de sobrevida celular; menores atividades extracelulares de LDH; e menores amplitudes das variações transientes das [Ca2+]i. Em conjunto, nossos resultados indicam que a inibição da succinato desidrogenase potencializa os efeitos excitotóxicos dos NMDARs por meio da alteração das [Ca2+]i e, provavelmente, dos mecanismos de morte celular; enquanto a adenosina apenas tendeu à neuroproteção

ABSTRACT

Huntington's disease (HD) is a hereditary neurodegenerative pathology characterized by mutant huntingtin proteins (mHtt) expression, striatum D2-positive GABAergic medium spiny neurons (MSNs) cell death and hyperkinetic motor symptoms development. One hypothesis refers to the principle that mHtt potentiates the excitotoxic effects of NMDA receptor (NMDAR) stimulation by the inhibition of mitochondrial succinate dehydrogenase, resulting in [Ca2+]i imbalance, oxidative stress and apoptosis. Adenosine P1 purinergic receptor agonist is related to neuroprotective and neuromodulatory functions. Thus, we established two in vitro HD models based on the neurodifferentiation of murine embryonic stem cell lines E14-TG2a and hippocampal neuroprogenitor cell line HT-22 followed by treatment with quinolinic acid (QA) selective agonist of NMDARs , in the absence and in the presence of 3-nitropropionic acid (3-NP) irreversible inhibitor of succinate dehydrogenase. These models were used to assess the neuroprotective functions of adenosine. Post-mitotic neurons from differentiated E14-TG2a cultures were characterized according to striatum's GABAergic MSNs; while the differentiated HT-22 neurons were characterized in a non-specific way. Methodology included immunofluorescence (microscopy and cytometry); real-time PCR; analysis of variations in the plasma membrane potentials and of transient variations in the [Ca2+]i by microfluorimetry; and quantification of AlamarBlue® reductions (% cell survival) and of extracellular LDH activity (U/L) (necrosis) by spectrometry. We evaluated the ability of 3-NP to potentiate the excitotoxic effects of QA by comparing two groups of differentiated HT-22 neurons 8mM QA (control); and 5mM 3-NP/8mM QA. We evaluated the neuroprotective potential of adenosine comparing four groups of differentiated HT-22 neurons QA 8mM; 250µM adenosine/8mM QA; 5mM 3-NP/8mM QA; 5mM 3-NP/250µM adenosine/8mM QA. Postmitotic neurons derived from E14TG2a were classified as striatums GABAergic MSNs that are part of a heterogeneous neuronal culture similar to nigrostriatal, corticostriatal, striatonigral, and striatopallidal connections. Differentiated HT-22 neurons consisted of a heterogeneous neuronal culture and not fully mature glutamatergic,dopaminergic, cholinergic and GABAergic neurons. Differentiated HT-22 neurons following 5mM 3-NP treatment showed lower % cell survival after treatments with 8mM QA for 24h (p<0.05); and higher amplitudes of the variations of [Ca2+]i induced by 8mM QA (p<0.05) (kinetics 6 minutes). On the other hand, differentiated HT-22 neurons 5mM 3-NP showed lower extracellular LDH activities after treatment with 8mM QA for 24h indicating a lower proportion of necrotic cells. Pretreatments with 250µM adenosine indicated a trend towards neuroprotective effects, such as higher percentages of cell survival; lower extracellular LDH activities; and lower amplitudes of transient variations of [Ca2+]i. Taken together, our results indicate that succinate dehydrogenase inhibition potentiated the excitotoxic effects of NMDARs by altering [Ca2+]i and, probably, cell death mechanisms, while adenosine only to neuroprotection