Amplificación directa de ADN de Bordetella pertussis purificado de hisopados nasofaríngeos por un método de bajo costo, rápido (60-segundos) y libre de equipos / Direct amplification of Bordetella pertussis DNA purified from nasopharyngeal swabs by a low-cost, fast (60-second), and equipment-free method

RESUMEN

RESUMEN Objetivo. Desarrollar y evaluar un método de bajo costo basado en celulosa para la purificación rápida y amplificación directa de ADN de Bordetella pertussis de hisopados nasofaríngeos. Materiales y métodos. Se prepararon discos de celulosa y se evaluaron diferentes parámetros (buffers de lisis/lavado, número de discos y elución de ADN). El método se acopló a una amplificación directa por PCR en tiempo real (qPCR) y se estimó el rendimiento utilizando hisopados nasofaríngeos que fueron positivos (n=100) y negativos (n=50) para ADN B. pertussis por qPCR, comparado con el método basado en columnas de sílice. Se calculó el grado de concordancia, sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN). Se evaluó la factibilidad del método rápido para ser acoplado a un ensayo colorimétrico de amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP). Resultados. El método rápido con un disco de celulosa y buffer de lisis y lavado conteniendo PVP-40 y Tween 20, respectivamente, mostró una mayor capacidad para purificar ADN amplificable de B. pertussis. El método tuvo una sensibilidad de 89,0% (IC95%, 80,2%-94,9%) y una especificidad de 98,5% (IC95%, 92,1%-100,0%), con un buen grado de concordancia (Kappa=0,867; IC95% 0,788 - 0,946), respecto al método referencial. Los VPP y VPN fueron 98,6% (IC95%, 92,7,2%-100,0%) y 88,2% (IC95%, 78,7%-94,4%), respectivamente. Se evidenció una amplificación exitosa por LAMP, y se obtuvieron resultados comparables con el método por columnas de sílice. Conclusión. El método desarrollado es simple, de bajo costo y libre de equipos para la obtención rápida (60 segundos) de ADN en el punto de atención, y puede ser implementado en diversas técnicas moleculares orientados al diagnóstico oportuno y al estudio epidemiológico de tos ferina.

ABSTRACT

ABSTRACT Objective. To develop and evaluate a low-cost cellulose-based method for rapid purification and direct amplification of Bordetella pertussis DNA from nasopharyngeal swabs. Materials and methods. We prepared cellulose discs and evaluated different parameters (lysis/wash buffers, number of discs and DNA elution). The method was coupled to a direct real-time PCR (qPCR) amplification and the performance was estimated using nasopharyngeal swabs that were positive (n=100) and negative (n=50) for B. pertussis DNA by qPCR, compared to the silica column-based method. We calculated sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) and the degree of agreement. The feasibility of the rapid method to be coupled to a loop-mediated isothermal amplification colorimetric assay (LAMP) was evaluated. Results. The rapid method, with a cellulose disk and lysis and wash buffer containing PVP-40 and Tween 20, respectively, showed a greater capacity to purify amplifiable DNA from B. pertussis. The method had a sensitivity of 89.0% (95%CI 80.2%-94.9%) and a specificity of 98.5% (95%CI 92.1%-100.0%), with a good degree of agreement (Kappa=0.867; 95%CI 0.788 - 0.946), compared to the reference method. The PPV and NPV were 98.6% (95%CI 92.7.2%-100.0%) and 88.2% (95%CI 78.7%-94.4%), respectively. Successful amplification by LAMP was evident, and comparable results were obtained with the silica column method. Conclusion. The developed method is simple, low-cost and equipment-free for rapid (60 seconds) DNA collection at the point of care, and can be implemented in various molecular techniques aimed at the timely diagnosis and epidemiological study of pertussis.