A via Nrf2 participa da maior modulação endotelial induzida pela prenhez sobre reatividade de aortas à fenilefrina / The Nrf2 pathway participates in the greater endothelial modulation induced by pregnancy on reactivity of aortas to phenylephrine

RESUMO

Alterações em diferentes vias de sinalização levam a disfunção vascular e endotelial e consequentemente a hipertensão. A hipertensão está relacionada diretamente com o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e diminuição da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) nos vasos sanguíneos. A via do Nrf2 (fator nuclear eritróide 2) está envolvida nos mecanismos que levam ao aumento da biodisponibilidade vascular de NO, pois controla a expressão de enzimas antioxidantes. A ativação do Nrf2 é modulada por sua ligação com a Keap-1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) e sua atividade é modulada pelo fator de transcrição Bach-1, que compete pelo mesmo sitio ativo no DNA com o Nrf2. Em ratas normotensas e em ratas espontaneamente hipertensas (SHR) é observada uma redução da pressão arterial ao final da prenhez, que tem sido associada à redução do estresse oxidativo e maior biodisponibilidade de NO. Com o aumento da biodisponibilidade de NO, é aumentada a modulação do endotélio sobre a reatividade vascular à agonistas vasoconstritores, como à fenilefrina (PE). Levantamos a hipótese que a prenhez altera a expressão e ou a atividade do Nrf2 e de seus inibidores Keap-1 e Bach-1 e que estas possíveis alterações estariam associadas à maior modulação endotelial sobre contração de aortas à PE. Para testarmos esta hipótese, a expressão de Nrf2, Keap-1 e Bach-1 e também das enzimas antioxidantes transcritas pelo Nrf2, como a NADP(H) quinona oxirredutase-1 (NQO1), SOD-1 e SOD-2 foram avaliadas em aortas de ratas prenhes e comparadas as aortas de ratas não-prenhes. A fim de identificarmos outros possíveis mecanismos alterados pela prenhez em ratas Wistar e SHR, avaliamos a expressão de NOXO-1, subunidade regulatória da NOX1 e de p47phox, subunidade regulatória de NOX2. A participação do Nrf2 na produção de NO endotelial em aortas de ratas prenhes, foi avaliada pela utilização de Brusatol, uma droga inibidora do Nrf2. Avaliamos também a participação do Nrf2 na reatividade de aortas de ratas prenhes à fenilefrina e à acetilcolina, utilizando o Brusatol. Todos os resultados foram comparados entre ratas não-prenhes normotensas (Wistar) e hipertensas (SHR) e entre ratas não-prenhes e prenhes nos grupos (análise de multivariância, post-test Tukey, p< 0,05). Os resultados mostraram que a expressão de Nrf2 está aumentada em aortas de ratas prenhes Wistar, apesar da expressão de Keap-1 e de Bach1 não estar alterada. Associado a expressão aumentada de Nrf2 observamos maior expressão de SOD-2, mas não de SOD-1 ou NQO1, em aortas de ratas prenhes. Em aortas de ratas SHR não prenhes, observamos entre todas as proteínas avaliadas, menor expressão de Bach-1 e de NQO1 quando comparadas às aortas de ratas normotensas. A prenhez reduziu ainda mais a expressão apenas de NQO1 em aortas de SHR. A prenhez reduziu a expressão de NOXO-1 e de p47phox em aortas de SHR, enquanto que em aortas de ratas Wistar reduziu apenas a expressão de NOXO-1. Os resultados obtidos neste estudo mostraram também que a incubação de HUVEC com Brusatol aumentou as concentrações intracelulares de ERO, mas não alterou as concentrações de NO, no entanto, reduziu significativamente a concentração de NOx estimulada pela ACh em aortas de ratas prenhes, Wistar ou SHR. Além disto, o Brusatol aumentou a reatividade à PE em aortas de ratas normotensas não prenhes e prenhes, igualando a reatividade de aortas de ratas prenhes as aortas de ratas não prenhes. No entanto, o Brusatol não alterou a reatividade de aortas de SHR, prenhes ou não-prenhes. Nenhum efeito significativo do Brusatol foi observado na reatividade à Acetilcolina em aortas de ratas Wistar ou SHR, prenhes ou não prenhes. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a atividade da via de sinalização do Nrf2 está aumentada, favorecendo a maior atividade de enzimas antioxidantes como a SOD-2, que contribuiria para maior biodisponibilidade de NO e maior modulação endotélio-dependente da contração vascular à PE em aortas de ratas normotensas prenhes. No entanto, em aortas de SHR prenhes, este mecanismo parecer não ser mais importante que a redução da atividade de isoformas NOX e de suas subunidades regulatórias que contribuiria para menor geração de O2•- e consequentemente, maior biodisponibilidade de NO(AU)

ABSTRACT

Modifications in different signaling pathways lead to vascular and endothelial dysfunction and, consequently, hypertension. Hypertension is directly related to an increase in the production of reactive oxygen species (ROS) and a decrease in the bioavailability of nitric oxide (NO) in blood vessels. The Nrf2 (erythroid nuclear factor 2) pathway is involved in the mechanisms that lead to the increased vascular bioavailability of NO, as it controls the expression of antioxidant enzymes. The activation of Nrf2 is modulated by Keap-1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) and its activity is modulated by the transcription factor Bach-1, which competes for the same active site in DNA with Nrf2. In normotensive rats and spontaneously hypertensive rats (SHR), a reduction in blood pressure at the end of pregnancy is observed, which has been associated with a reduction in oxidative stress and greater bioavailability of NO. This increased NO bioavailability has been associated with the higher endothelium modulation over blood vessel reactivity to vasoconstrictor agonists, such as phenylephrine (PE), observed in pregnant rats. We hypothesized that pregnancy alters the expression and/or activity of Nrf2 and its inhibitors Keap-1 and Bach-1 and that these changes are associated with greater endothelial modulation on the contraction of aortas to PE. To test this hypothesis, the expression of Nrf2, Keap-1 and Bach-1 and the antioxidant enzymes transcribed by Nrf2, such as NADP (H) quinone oxidoreductase-1 (NQO1), SOD-1 and SOD-2 were evaluated in aortas of pregnant rats and compared to aortas of non-pregnant rats. In order to identify other possible mechanisms altered by pregnancy in Wistar rats and SHR, we evaluated the expression of NOXO-1, NOX1 regulatory subunit and p47phox, NOX2 regulatory subunit. The role of Nrf2 in the production of endothelial NO in aortas of pregnant rats was evaluated by use of Brusatol, an inhibitor of Nrf2. We also evaluated the role of Nrf2 in the reactivity of aortas of pregnant rats to phenylephrine and acetylcholine, using Brusatol. All results were compared between normotensive (Wistar) and hypertensive (SHR) non-pregnant rats and between pregnant and non-pregnant rats in the groups (multivariate analysis, Tukey post-test, p< 0.05). The results showed that the expression of Nrf2 is increased in aortas of pregnant Wistar rats, although the expression of Keap-1 and Bach-1 is not altered. The increased expression of Nrf2 was associated with the greater expression of SOD-2, but not of SOD-1 or NQO1, in aortas of pregnant rats. In aortas of non-pregnant SHR rats, we observed among all evaluated proteins, lower expression of Bach-1 and NQO1 when compared to the aortas of normotensive rats. Pregnancy reduced even more the expression of NQO1 in SHR aortas. Pregnancy reduced the expression of NOXO-1 and p47phox in SHR aortas, whereas in aorta of Wistar rats it reduced only the expression of NOXO-1. The results obtained in this study also showed that the incubation of HUVEC with Brusatol increased the intracellular concentrations of ROS, but did not alter the concentrations of NO, however, Brusatol significantly reduced the concentration of NOx stimulated by ACh in aortas of pregnant rats, Wistar or SHR. Moreover, Brusatol increased the reactivity to PE in aortas of pregnant normotensive rats and pregnant, matching the reactivity of aortas of pregnant rats to aortas of non-pregnant rats. However, Brusatol did not alter the reactivity of pregnant or non-pregnant SHR aortas. No significant effect of Brusatol was observed in the reactivity to Acetylcholine in aortas of Wistar rats or SHR, pregnant or non-pregnant rats. In conclusion, our results suggest that the activity of the Nrf2 signaling pathway is increased, favoring the greater activity of antioxidant enzymes such as SOD-2, which would contribute to greater bioavailability of NO and greater endothelium-dependent modulation of vascular contraction to PE in aortas of pregnant normotensive rats. However, in pregnant SHR aortas, this mechanism appears to be no more important than the lower the activity of NOX isoforms and their regulatory subunits that would contribute to lower O2•- generation and, consequently, greater NO bioavailability(AU)