Estudo exploratório da Síndrome Hipoplasia Cartilagem-Cabelo no Brasil: uma abordagem genômica, proteômica e de análise estrutural de RNA / Exploratory study of Hypoplastic Cartilage-Hair Syndrome in Brazil: a genomic, proteomic and RNA structural analysis approach

RESUMO

A Hipoplasia Cartilagem-Cabelo (do inglês, Cartilage Hair Hypoplasia; CHH) é uma doença autossômica recessiva descrita por McKusick et al., em 1964 em crianças da comunidade Amish. Clinicamente, os pacientes apresentam displasia óssea metafisária em diferentes graus de gravidade. Além disso, também pode ser observado hipotricose e imunodeficiência. Já no âmbito molecular, a condição se caracteriza por variantes patogênicas do gene RMRP. Apesar de ter sido delineada há quase 60 anos, ainda não existe uma correlação genótipo-fenótipo bem compreendida. Este trabalho é uma continuação do trabalho de mestrado realizado no IFF/Fiocruz, durante 2017 e 2018, no qual foi descrita uma coorte de 23 pacientes brasileiros com CHH em que foram encontradas diversas variantes patogênicas. Dentre estas, a variante g.196C>T destacou-se por sua elevada frequência no grupo estudado, diferentemente do observado em pacientes de outras nacionalidades, sugerindo um possível efeito fundador (EF) para a população brasileira. Esse trabalho teve por objetivo realizar diferentes ensaios moleculares para auxiliar na compreensão da CHH, além de investigar a hipótese de uma origem ancestral comum da variante g.196C>T. O estudo foi dividido em 4 eixos, sendo três relacionados às pesquisas de caráter exploratório dos mecanismos da doença e um dedicado à análise do EF. Dentro deste último, utilizando um painel de marcadores do tipo TAG SNPs cuidadosamente selecionados, foi observado que cromossomos de diferentes regiões brasileiras carregando o nucleotídeo T na posição196 do gene RMRP compartilharam o haplótipo T/C/G/A (16/17 haplótipos), apontando para uma origem comum desta substituição de base no gene RMRP. Adicionalmente, foram realizadas análises de proteômica comparativa, evidenciando que o perfil proteômico dos leucócitos de pacientes e controles expressam proteínas que traduzem vias moleculares distintas, além de apresentar diferenças de expressão de proteínas importantes relacionadas aos fenótipos clínicos da doença. Também foram realizados ensaios de RT-qPCR que mostraram que tanto os níveis do RNA RMRP, quanto dos dois pequenos RNAs derivados de RMRP, estavam significativamente reduzidos nos pacientes em relação ao grupo controle. Por fim, com o intuito de tentar prever o impacto das variantes na estrutura tridimensional do RNA, foi realizada uma análise in silico que mostrou que as alterações patogênicas identificadas nos pacientes ocorreram tanto em regiões conservadas entre espécies de mamíferos quanto em domínios essenciais para o complexo ribonucleoproteico. Duas alterações estão localizadas em regiões associadas à biogênese dos pequenos RNAs derivados de RMRP. Além disso, foi possível observar que certas variantes podem alterar o pareamento de bases e a topologia da estrutura das alças da molécula, o que poderia influenciar na montagem do complexo RNAse MRP. Em conjunto, os dados desta tese lançam luz sobre diversos pontos ainda não explorados para CHH, além de dar suporte para novos estudos que tenham por objetivo viabilizar uma medicina de precisão, contribuindo para minimizar os impactos da doença e para a promoção da qualidade de vida dos pacientes.

ABSTRACT

Cartilage Hair Hypoplasia (CHH) is an autosomal recessive disease described by McKusick et al. in 1964 in the Amish community. Clinically, patients present metaphyseal bone dysplasia in different degrees of severity. In addition, hypotrichosis and immunodeficiency may also be present. At the molecular level, the condition is characterized by pathogenic variants of the RMRP gene. Although CHH has been described more than 60 years ago, the genotype-phenotype correlation is still not well-understood. This work is a continuation of the dissertation carried out at IFF/Fiocruz, during 2017 and 2018, in which a cohort of 23 Brazilian patients with CHH was described and several pathogenic variants were found. Among these, the high frequency of g.196C>T variant in the studied group called our attention, unlike that observed in patients of other nationalities, suggesting a possible founder effect (EF) in the Brazilian population. This work aimed to perform different molecular assays to aid in the understanding of CHH, in addition to investigating the hypothesis of a common ancestral origin of the g.196C>T variant. The study was divided into 4 axes, three related to exploratory research on disease mechanisms and one dedicated to the analysis of EF. Within the latter, using a carefully selected panel of TAG SNPs markers, it was observed that chromosomes from different Brazilian regions carrying T at nucleotide 196 of the RMRP gene shared the T/C/G/A haplotype (16/17 haplotypes), indicating a common origin of this base substitution at position 196 of the RMRP gene. Additionally, comparative proteomics analysis was performed, showing that the proteomic profile of leukocytes from patients and controls express proteins that translate distinct molecular pathways, in addition to presenting differences in the expression of proteins related to important clinical phenotypes of the disease. RT-qPCR assays were also performed, which showed that both RMRP RNA levels and the two RMRP-derived small RNAs were significantly reduced in patients compared to the control group. Finally, in order to try to predict the impact of the variants on the three-dimensional structure of the RNA, an in silico analysis was performed which showed that the pathogenic alterations identified in the patients occurred both in regions conserved between mammalian species and in domains essential for the ribonucleoprotein complex. Two alterations are located in regions associated with the biogenesis of RMRP-derived small RNAs. In addition, it was possible to observe that certain variants can change the base pairing and the topology of the structure of the molecule's loops, which could influence the assembly of the RNAse MRP complex. Together, the data from this thesis shed light on several points not yet explored for CHH, in addition to providing support for new studies that aim to enable a precision medicine toward CHH patients, helping to minimize the impacts of the disease and to promote quality of life of patients.