Influência de moléculas autoindutoras produzidas por Escherichia coli na formação de biofilme por Listeria monocytogenes / Influence of autoinducers produced by Escherichia coli on biofilm formation by Listeria monocytogenes

RESUMO

Listeria monocytogenes é um micro-organismo Gram-positivo que está comumente associado a doenças de origem alimentar. Possui a capacidade de sobreviver a condições adversas e de formar biofilme em diferentes superfícies abióticas, tornando-se um problema constante para a indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização e aumentar o risco de contaminação pós-processamento. A formação de biofilme pode ser regulada por um mecanismo denominado quorum sensing, no qual ocorre intensa comunicação célula-célula, mediada por moléculas químicas, chamadas de autoindutoras. Pouco se sabe sobre a ocorrência de interação entre bactérias Gram- positivas e negativas na formação de biofilmes, sendo mais frequentes estudos entre bactérias do mesmo grupo. A fim de avaliar a ocorrência de interação entre Escherichia coli e L. monocytogenes (Lm), desenvolveu-se esta pesquisa com os seguintes objetivos: i) verificar a capacidade de Lm sorotipo 1/2a selvagem e sua mutante isogênica (ΔprfA ΔsigB) formar biofilme em presença de Escherichia coli, avaliando-se a importância dos reguladores de virulência, prfA e sigB, no processo; e ii) verificar a produção e interferência de moléculas autoindutoras de E. coli E2348/69 na formação de biofilme por Lm. Os ensaios de formação de biofilme foram realizados utilizando-se lâminas de aço-inoxidável AISI 304 #4 imersas em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) e em meio pré-condicionado (MPC) por E. coli, com incubação a 25 ºC. Foram testadas duas concentrações iniciais de Lm (102 e 106 UFC.mL-1) e amostragens em diferentes tempos de incubação. Utilizou-se um método de quantificação indireto com coloração do biofilme por cristal violeta e posterior leitura da absorbância. Observou-se que Lm 1/2a selvagem e sua mutante isogênica (ΔprfA ΔsigB) são capaz de formar biofilme na presença de Escherichia coli e que uma maior quantidade de biofilme foi formada por Lm selvagem quando comparada à sua mutante, em meio não pré-condicionado (controle), indicando que prfA e sigB estão envolvidos no processo de formação de biofilme. Quando em MPC, o biofilme formado pela cepa selvagem foi menor que no meio controle (BHI), indicando que E. coli E2348/69, utilizada no pré-condicionamento do meio, produz moléculas capazes de interferir no processo de formação e na quantidade de biofilme formado por Lm; e para o biofilme formado pela cepa mutante, houve uma maior quantificação em MPC em comparação ao meio controle, o que sugere que os genes deletados possam estar envolvidos no reconhecimento das moléculas autoindutoras. Assim, os dados obtidos permitem concluir que há interação e interferência por parte de E. coli na formação de biofilme por Lm mediante produção de moléculas autoindutoras

ABSTRACT

Listeria monocytogenes (Lm) is a Gram-positive microorganism commonly associated with foodborne diseases. Due to its ability to survive under adverse environmental conditions and to form biofilm in different abiotic surfaces, this bacterium is a concern for the food industry, since it can compromise sanitation procedures and increase the risk of post-processing contamination. Biofilm formation can be regulated by a quorum sensing mechanism, in which there is intense cell-cell communication mediated by chemical molecules, called autoinducers. Little is known about the occurrence of interaction between Gram-positive and Gram-negative bacteria on biofilm formation. Thus, in order to evaluate the occurrence of interaction between Escherichia coli and Lm, this study was developed including the following objectives: i) to evaluate the ability of Lm 1/2a and its isogenic mutant strain (ΔprfAΔsigB) to form biofilm on the presence of Escherichia coli, assessing the importance of virulence regulators, prfA and sigB, in this process; and ii) to verify the production and interference autoinducers of E. coli E2348/69 on biofilm formation by Lm. Biofilm formation assays were conducted using stainless steel AISI 304 #4 immersed into broth brain heart infusion (BHI) and into preconditioned medium (MPC) by E. coli, following incubation at 25 °C. Lm at two initial concentrations (102 and 106 CFU.mL-1) and under different incubation time was tested. An indirect method for quantification of cells was applied, using crystal violet to color the biofilm, followed by optical density measurement. It was observed that Lm 1/2a and its isogenic mutant (ΔprfA ΔsigB) are able to form biofilm in the presence of Escherichia coli and a larger amount of biofilm was formed by wild strain Lm compared to its mutant, in a non-preconditioned medium (control), indicating that prfA and sigB are involved in biofilm formation. For MPC, the biofilm formation by the wild strain was lower than in the control (BHI), indicating that E. coli E2348/69, used in the preconditioned medium, produces molecules that can affect the formation process and the amount of biofilm formed by Lm; and in the biofilm formed by the mutant strain, there was a higher quantification of MPC compared to the control, suggesting that the deleted genes may be involved in recognition the of autoinducers. These results suggest that there is an interaction and interference of E. coli on biofilm formation by Lm due the production of autoinducers