Estudos sobre a organização genômica, evolução e expressão de microRNAs / Studies on the genomic organization, evolution and expression of microRNAs

RESUMO

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores de proteínas presentes na maioria dos eucariotos. Esses RNAs regulam a expressão gênica em nível pós-transcricional através do silenciamento de mRNAs-alvo que possuem sítios complementares às suas sequências, atuando em praticamente todos os processos celulares. Embora a estrutura e função dos miRNAs estejam bem caracterizadas, aspectos relacionados à sua organização genômica, evolução e atuação em doenças são tópicos que apresentam enormes lacunas. Nesta tese, utilizamos abordagens computacionais para investigar estes temas em três trabalhos. No primeiro, processamos e integramos um vasto volume de dados publicamente disponíveis referentes aos miRNAs e genes codificadores de proteínas para cinco espécies de vertebrados. Com isso, construimos uma ferramenta web que permite a fácil inspeção da organização genômica dos miRNAs em regiões inter e intragênicas, o acesso a dados de expressão de miRNAs e de genes codificadores de proteínas (classificados em genes hospedeiros e não hospedeiros de miRNAs), além de outras informações pertinentes. Verificamos que a ferramenta tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica e acreditamos que ela possa facilitar a geração de hipóteses associadas à regulação dos miRNAs, principalmente quando estão inseridos em genes hospedeiros. No segundo estudo, buscamos compreender como o contexto genômico e a origem evolutiva dos genes hospedeiros influenciam a expressão e evolução dos miRNAs humanos. Nossos achados mostraram que os miRNAs intragênicos surgem preferencialmente em genes antigos (origem anterior à divergência de vertebrados). Observamos que os miRNAs inseridos em genes antigos têm maior abrangência de expressão do que os inseridos em genes novos. Surpreendentemente, miRNAs jovens localizados em genes antigos são expressos em um maior número de tecidos do que os intergênicos de mesma idade, sugerindo uma vantagem adaptativa inicial que pode estar relacionada com o controle da expressão dos genes hospedeiros, e como consequência, expondo-os a contextos celulares e conjuntos de alvos diversos. Na evolução a longo prazo, vimos que genes antigos conferem maior restrição nos padrões de expressão (menor divergência de expressão) para miRNAs intragênicos, quando comparados aos intergênicos. Também mostramos possíveis associações funcionais relacionadas ao contexto genômico, tais como o enriquecimento da expressão de miRNAs intergênicos em testículo e dos intragênicos em tecidos neurais. Propomos que o contexto genômico e a idade dos genes hospedeiros são fatores-chave para a evolução e expressão dos miRNAs. Por fim, buscamos estabelecer associações entre a expressão diferencial de miRNAs e a quimioresistência em câncer colorretal utilizando linhagens celulares sensíveis e resistentes às drogas 5-Fluoruracil e Oxaliplatina. Dentre os miRNAs identificados, o miR-342 apresentou níveis elevados de expressão nas linhagens sensíveis à Oxaliplatina. Com base na análise dos alvos preditos, detectamos uma significativa associação de miR-342 com a apoptose. A superexpressão de miR-342 na linhagem resistente SW620 evidenciou alterações na expressão de genes da via apoptótica, notavelmente a diminuição da expressão do fator de crescimento PDGFB, um alvo predito possivelmente sujeito à regulação direta pelo miR-342

ABSTRACT

MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs found in most eukaryotic species. These RNAs regulate gene expression at post-transcriptional level by silencing target mRNAs through base-pairing of complementary sequences, thus acting on virtually all cellular processes. Although the structure and function of miRNAs are well understood, several aspects related to their genomic organization, evolution and involvement with diseases are largely underexplored. In this thesis, we employed computational methods to investigate such issues in three different studies. In the first one, we have processed and integrated a large amount of public data related to miRNAs and coding genes for five vertebrate species. Then, we developed a webtool to allow the analysis of the miRNA genomic context in inter and intragenic regions, the access of miRNA and gene expression data (classified as host and non-host genes), as well as other relevant information. We noticed that the webtool has been largely used by the scientific community, and we believe that it can facilitate hypothesis generation related to miRNA regulation, especially when they are within host genes. In the following study, we sought to understand how the genomic context and the evolutionary origin of host genes can affect the expression and evolution of human miRNAs. Our findings showed that intragenic miRNAs are preferentially embedded within old host genes (originated before the split of vertebrates). We observed that miRNAs within old genes are more broadly expressed than those within young genes. Surprisingly, young miRNAs within old genes were expressed in more tissues than their intergenic counterparts, suggesting an initial adaptive advantage which might be related to their hosts expression control, and as a consequence, exposing them to a more diverse cellular contexts and target genes. In the long run, we found that old host genes lead to expression constraints (lower expression divergence) between species for intragenic miRNAs, in respect to intergenic ones. We also showed possible functional associations related to miRNA genomic context, such as the enrichment of young intergenic miRNAs in testis, while young intragenic miRNAs were enriched in neural tissues. Thus, we propose that the genomic context and the age of the host genes are key factors in shaping the expression and evolution of miRNAs. Finally, we sought to establish associations between differential expression of miRNAs and chemoresistance in colorectal cancer using resistant and sensitive cell lines to 5-Fluoruracil and Oxaliplatin. Among differentially expressed miRNAs, miR-342 was highly expressed in sensitive cell lines to Oxaliplatin. Based on target prediction analysis, miR-342 is likely associated with apoptosis. The induced overexpression of miR-342 in SW620, a cell line resistant to Oxaliplatin, changed the expression levels of genes linked to the apoptosis pathway, notably the downregulation of PDGFB growth factor, which is a predicted target possibly subjected to direct regulation by miR-342