Avaliação da correlação entre peroxidação lipídica e o perfil de marcadores inflamatórios em pacientes com Diabetes mellitus tipo 2, dislipidemia e periodontite crônica / Correlation between lipid peroxidation and inflammatory markers profile in Diabetes mellitus type 2 patients with dyslipidemia and chronic periodontal disease

RESUMO

O presente estudo teve por objetivo avaliar os níveis locais e sistêmicos de peroxidação lipídica (LPO) e sua correlação com o perfil de marcadores inflamatórios, locais e sistêmicos em com Diabetes mellitus (DM) tipo 2, dislipidemia e periodontite crônica, comparando-os a indivíduos sem diabetes. Além disso, buscou-se propor um método validado para avaliar o malondiadeído (MDA) no fluido sulcular gengival de sítios saudáveis e doentes. A amostra foi constituída de 120 pacientes com doença periodontal crônica divididos em 4 grupos Grupo1 (DM descompensado); Grupo2 (DM compensado); Grupo3 (sem diabetes com dislipidemia); Grupo 4 (sistemicamente saudável). Toda a amostra foi submetida a exame periodontal completo, exame físico e avaliação laboratorial para verificação da glicemia de jejum, hemoglobina glicada (HbA1c), insulina, proteína C-reativa e perfil lipídico. O exame periodontal consistiu na avaliação do índice de placa visível, do índice de sangramento marginal, da posição da margem gengival, da profundidade de sondagem, do sangramento à sondagem e do nível clínico de inserção. Para todos os grupos foram coletadas amostras de fluido sulcular gengival (FSG) (4 sítios sem periodontite e 4 sítios com periodontite) e de sangue para obtenção do plasma sanguíneo. Os níveis de peroxidação lipídica representados pelo MDA, avaliado por HPLC, e pelo LDL oxidado (LDLox), avaliado por ELISA, foram quantificados no fluido sulcular gengival e no plasma. Foram avaliadas ainda as citocinas (IL)-1E, -2, - 4, -5, -6, -7, -8, -10, -12, -13 e fator de necrose tumoral α (TNF-α) no FSG e no plasma. Foi possível determinar e validar o método de avaliação no fluido sulcular gengival, com alta precisão, sendo que os coeficientes de variação intra- e inter-dias encontrados foram abaixo de 6.3% e 12.4%, respectivamente. O método foi considerado sensível e capaz de detectar o MDA em pequenas quantidades, sendo o limite de quantificação (S/N = 5) de 0.03 µM, permitindo avaliação deste marcador no fluido de sítios saudáveis. Foi observado que os sítios com doença periodontal apresentavam-se com valores maiores de MDA do que os sítios saudáveis. Os resultados mostraram que o grupo 1 apresentou maior severidade da doença periodontal quando comparado aos demais grupos, em especial quanto ao sangramento à sondagem, profundidade de sondagem≥6mm, nível de inserção clínica≥5mm e supuração. Em relação aos parâmetros de LPO local e sistêmico, os grupos com diabetes apresentaram maiores níveis de peroxidação quando comparados aos grupos sem diabetes, sendo que o grupo 1 apresentou diferença significativa também em relação ao grupo 2. Em relação às citocinas inflamatórias no FSG, foi observado que o TNF-α, IL-6 e IL-10 estavam significativamente aumentadas no fluido de pacientes com diabetes, sendo esta diferença maior no grupo 1. Foram verificadas correlações positivas e significantes entre os níveis de peroxidação lipídica e citocinas no FSG (IL6, IL-10, TNF-α) bem como com parâmetros de doença periodontal, dentre estes sangramento à sondagem, profundidade de sondagem ≥ 6mm, nível de inserção clínica ≥ 5mm e presença de supuração. Já no plasma, a expressão das citocinas seguiu um padrão decrescente do grupo 1 ao grupo 4 tanto para citocinas pró- quanto anti-inflamatórias, sendo esta diferença significante para (IL)-1E, -4, -6, -8 e TNF-α. Esta diferença ocorreu em maior magnitude no grupo 1, embora nos pacientes portadores de diabetes com adequado controle metabólico os níveis destas citocinas também estivessem mais elevados em relação aos pacientes saudáveis. Os níveis de LPO plasmática apresentaram correlação intermediária e positiva (p<0.0001) com níveis de IL1- ß(0.50), TNF-α.(0.40) e IL-6(0.40). Concluimos que a peroxidaçao lipídica pode ser um mecanismo importante na expressão aumentada de marcadores inflamatórios e maior severidade da doença periodontal no paciente com DM e dislipidemia

ABSTRACT

The aim of this study is to evaluate the levels of the lipid peroxidation and its correlation with systemic and local inflammatory markers profile in patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) dyslipidemia and chronic periodontitis compared to systemically healthy patients. We also aimed to quantify a specific product of the lipid peroxidation process, malondialdehyde (MDA), in gingival crevicular fluid and to describe the validation of this method in this matrix using HPLC. The study sample comprised 120 patients divided into four groups with 30 patients in each group group 1- diabetes with poor metabolic control with dyslipidemia, group 2- diabetes with good metabolic control, group 3- without diabetes with dyslipidemia and group 4- systemically healthy. All the subjects will go through a complete periodontal examination and physical and laboratory evaluation in order to verify fasting plasma glucose, glycated hemoglobin (HbA1c), lipid profile, insulin and high sensitivity C-reactive protein. Periodontal examination will consist of visible plaque index, gingival bleeding index, bleeding on probing, probing depth (PD) and clinical attachment levels (CAL). Plasma and samples of gingival crevicular fluid (GCF) will be collected in 4 sites without periodontal disease and 4 sites with periodontal disease. The lipid peroxidation levels, evaluated by oxidized LDL (ox LDL) and MDA were measured in GCF and in plasma. Inflammatory cytokines, (IL)-1E, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -10, -12, -13 and tumor necrosis factor-alpha α (TNF-α) were also evaluated in plasma and GCF. It was possible to validate a HPLC-based method to identify and quantify the MDA in GCF with sensitivity, precision, and accuracy even in small concentrations as observed in healthy sites GCF. Samples' intra- and interday coefficients of variation were below 6.3% and 12.4%, respectively. The limit of quantitation (S/N = 5) was 0.03 µM. GCF in the periodontal diseased sites presented higher values of MDA than healthy sites for all groups. The results also showed that all the periodontal parameters were considered worse in group 1 (DM with inadequate metabolic control) when compared to the others groups, particularly BOP, PD ≥ 6mm, CAL ≥ 5mm and suppuration. Regarding lipid peroxidation evaluated by MDA in plasma and in gingival crevicular fluid (GCF), significant differences were observed between the groups with diabetes when compared to the groups without DM and G1 presented higher values of MDA when compared to G2 (p<0.05). The local inflammation assessed by cytokines in GCF(IL6, IL-10, TNF-α) increased in all diabetic patients, being significant in the group with poorly controlled diabetes and dyslipidemia. It was possible to verify significant and positive correlations between GCF lipid peroxidation markers, GCF cytokines (IL6, IL-10, TNF-α) and periodontal parameters such as bleeding on probing, PD ≥ 6mm, CAL ≥ 5mm and presence of suppuration. The cytokines panel in plasma showed a decreasing pattern from the poorly controlled diabetes to the healthy group being significant to (IL)-1E, -4, -6, -8 e TNF-α. This difference was more evident is group 1 but even in well-controlled DM with dyslipidemia the levels of MDA, OxLDL and inflammatory cytokines were significantly increased when compared to the non DM/dyslipidemic group. There was a wide range of, moderate positive, correlations observed between DM status, LPO markers and inflammatory cytokines expression, such as MDA and IL1-ß(0.50); MDA and TNF-α.(0.40); MDA and IL-6(0.40). These findings indicate an important role for LPO in the severity of the local inflammatory response to bacteria and the susceptibility to periodontal disease in DM patients and suggest that LPO may represent an additive effect in the aggravation of inflammation in DM and a role of increased oxidative metabolism in the inflammatory response