Avaliação do efeito da Artin M no processo de reparação em mucosa mastigatória / Evaluation of Artin M on wound healing in palatal mucosa

RESUMO

Artin M é uma lectina purificada de sementes de Artocarpus heterophyllus que, recentemente, mostrou-se capaz depromover aceleração da cicatrização de lesões por queimadura de pele ou por abrasão da córnea em ratos e coelhos. O objetivo desta tese foi avaliar os efeitos da Artin M no processo de reparação da mucosa mastigatória bucal, por meio de modelos de estudo in vivo. Primeiro estudo Três feridas cirúrgicas circulares de 6 mm de diâmetro foram criadas na mucosa palatina de 20 cães, e divididas aleatoriamente em 3 grupos de acordo com os tratamentos C ­ controle (não tratados), A - Artin M, V - veículo. Quatro animais de cada grupo foram sacrificados após 2, 4, 7, 14 e 21 dias pós tratamento e suas maxilas analisadas clinicamente quanto ao padrão de cicatrização, seguido de análise histológica, imuno-histoquímica para antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e atividade de mieloperoxidase. Clinicamente, o grupo A demonstrou melhor cicatrização em todos os períodos quando comparada aos outros grupos (p<0,05). A análise histológica mostrou ter havido no grupo A maior estimulação na produção de fibras colágenas, maturação do tecido de granulação e organização do epitélio. A imunolocalização de PCNA mostrou uma maior tendência na proliferação celular em lesões do grupo A principalmente nos dias iniciais (p<0,05). O influxo de neutrófilos mostrou-se estatisticamente aumentado no grupo A quando comparado aos outros grupos nos dias 2 e 4 (p<0,05). Conclui-se que a Artin M promoveu aceleração na reparação das feridas na mucosa mastigatória em cães, via recrutamento de neutrófilos e indução da proliferação celular. É bem conhecido o envolvimento de mediadores biológicos como citocinas e fatores de crescimento liberados pelas diferentes células no processo de reparação tecidual. Portanto, tendo em vista os resultados obtidos no primeiro modelo visamos avaliar a resposta ao tratamento tópico do gel de Artin M na mucosa mastigatória de rato. Segundo estudo Feridas cirúrgicas circulares de 4 mm de diâmetro foram criados na mucosa palatina de 72 ratos Wistar, divididos aleatoriamente de acordo com o tratamento realizado nas lesões em 3 grupos C ­ controle (não tratados), A -Artin M, V - veículo. Após 3, 5 e 7 dias pós-tratamento, 8 animais de cada grupo foram sacrificados e suas hemimaxilas foram divididas para realização da análise histológica; imuno-histoquímica para PCNA, bFGF, VEGF e TGF-ß; expressão protéica das citocinas pró-inflamatórias IL-1, IL-6 e TNFα, e dos fatores de crescimento VEGF e TGF-ß por ELISA. A análise histológica mostrou que no grupo A houve estimulação na regeneração e organização do epitélio, na produção de fibras colágenas e maturação do tecido de granulação e diminuição estatisticamente significante no infiltrado inflamatório no dia 7 quando comparado aos outros grupos (p<0,05). A análise imuno-histoquímica mostrou maior expressão de TGF-ß e VEGF no dia 3 (p<0,05) e maior proliferação celular no dia 5 (p<0,05) no grupo A. Além disso, maior expressão protéica de TGF-ß e VEGF nas lesões tratadas pelo Artin M foi confirmada pela ELISA no dia 3 (p<0,05). Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que a aplicação tópica de gel de Artin M promoveu a reparação da mucosa mastigatória de ratos através estimulação na produção de TGF-ß e VEGF, proliferação celular, deposição de colágeno e reepitelização

ABSTRACT

Artin M, lectin from Artocarpus heterophyllus seeds, has been demonstrated to stimulate recruitment and activation of neutrophil and mast cells. Furthermore, it has been shown to accelerate the process of wound healing on burn injuries and corneal epithelial lesions in rats and rabbits, respectively. The aim of this study was to evaluate the effects of Artin M on wound healing in palatal mucosa in two animal models. Study 1 Three wounds of 6 mm full thickness were surgically created in the hard palate mucosa of twenty dogs. The wounds of each animal were randomly divided into three groups according to one of the treatment assigned C­ Control (nontreated), A- Artin M gel, and V­ Vehicle (carboxymethylcellulose 3% gel). Four animals per group were sacrificed at 2, 4, 7, 14 and 21 days post-surgery. Before sacrifice, wounded areas were photographed and scored for macroscopic healing evaluation. Afterwards, maxillary tissue were harvested and divided to perform histological analysis, immunohistochemical staining against Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) and measurement of myeloperoxidase activity. Clinical analysis showed that wound closure was accelerated in group A in comparison to other groups in all periods. Histological features showed enhanced reepithelization and collagen fiber formation resulting in faster maturation of granular tissue in group A compared to the other groups, by day 14. Artin M treatment significantly induced cells proliferation at day 2 and 4 (p<0.05). Neutrophils infiltration in the group A was significantly higher than in the other groups at days 2 and 4 (p<0.05). The results suggest that Artin M gel may potentially facilitate wound healing on palatal mucosa via the recruitment of neutrophils and promotion of cells proliferation. It is well known that cytokines and growth factors released from different cells coordinate the healing process. Therefore, based on previous results we evaluated the effects of topical application of Artin M on wound healing in palatal mucosa of rats. Study 2 Seventy-two rats were divided into three groups according to one of the treatment assigned C­ Control (non-treated), A- Artin M gel, and V­ Vehicle (carboxymethylcellulose 3% gel). A 4 mm full thickness wound was surgically created on the palatal mucosa of each animal. Eight animals per group were sacrificed at 3, 5, and 7 days post-surgery. Maxillary biopsies were harvested and divided to perform histological analysis, imunohistochemical analysis for bFGF, PCNA TGF-ß and VEGF and ELISA assay to evaluate levels of IL-1, IL-6, TNFα, TGF-ß and VEGF. Histological features showed faster reepithelization in group A, significant decrease in inflammatory cells infiltration by day 7 (p<0.05) and increased collagen fiber formation resulting in faster maturation of granular tissue compared to the other groups. Also, Artin M significantly induced cells proliferation at day 5 (p<0.05). Significantly higher expression of TGF-ß and VEGF were observed in group A compared to C at day 3 (p<0.05). In conclusion, the single application of Artin M gel has shown to be effective in the healing of oral mucosa wound in rats by enhancing TGF-ß and VEGF release, cell proliferation, reepithelization, collagen deposition and arrangement of collagen fibers. These findings may partially explain potential pharmacological actions of Artin M on promoting wound healing process