Eficácia do óleo de Melaleuca alternifolia sobre bactérias cariogênicas e sua citoxicidade sobre cultura de queratinócitos / Efficacy of Melaleuca alternifólia oil against cariogenic bacteria and cytotoxicity on keratinocytes culture

RESUMO

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho, dividido em dois estudos, foi avaliar in vitro o efeito do óleo de Melaleuca alternifolia (TTO) sobre as bactérias Streptococcus mutans (S.mutans) e Lactobacillus acidophilus (L.acidophillus) e seu possível efeito citotóxico sobre cultura de queratinócitos (HaCat). Materiais e Métodos: No estudo 1, a análise antimicrobiana foi avaliada em 3 fases 1. Identificação da CIM e CBM do TTO nas concentrações de 0.25% a 2% sobre os microrganismos na forma planctônica, utilizando-se a técnica de microdiluição em caldo; 2. Análise do metabolismo celular dos microrganismos em SSB (biofilme monoespécie) e DSB (biofilme multiespécie), formados em placa de cultura celular, tratados com diferentes concentrações de TTO, por meio de ensaio de XTT; 3. Análise do metabolismo celular dos microrganismos em DSB formado sobre blocos de esmalte e dentina e submetidos às seguintes soluções TTO 2%, clorexidina 0.12% (controle positivo) ou PBS (controle negativo) pelo tempo de 60 s, por meio de ensaio de XTT e análise das imagens obtidas por microscopia confocal de varredura a laser (MCVL). No estudo 2, a análise citotóxica de diferentes concentrações de TTO foi realizada sobre células HaCat usando diferentes tempos de contato (60 s, 2 h e 60 s, com recuperação de 24 h), por meio do ensaio de MTT para avaliação da atividade metabólica. Os dados obtidos apresentaram distribuição não normal e, portanto, foram utilizados os testes não-paramétricos de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney. Todos os testes estatisticos foram considerados em nível de significância de 5%. Resultados: Na análise antimicrobiana, para ambos, S.mutans e L.acidophillus, os valores de CIM e CBM foram 0.5% e 1 %, respectivamente. Os valores de densidade óptica (DO) referentes ao metabolismo bacteriano, obtidos pelo ensaio de XTT, apresentaram diferença estatisticamente significante para S. mutans SSB, em concentrações de TTO de 0.25 a 2%, e para L. acidophillus SSB, na concentração de 2% (p<0.05). Entretanto não houve diferença estatisticamente significante para DSB (p>0.05). Quando DSB sob blocos de esmalte e dentina foram expostos a diferentes soluções, os valores de DO apresentaram diferença estatíticamente significante para o TTO 2% (p<0.05), porém com menor efeito de diminuição de metabolismo que a CHX 0.12% (p<0.05). As imagens obtidas por meio da MCVL concordam com os dados do ensaio de XTT, indicando que o TTO aumentou o número de bactérias mortas sobre a superfície dos blocos. Na análise da citotóxicidade, os valores de DO referente ao metabolismo celular, obtidos pelo teste de MTT, apresentaram diferença estatistica (p<0.05) entre os grupos controle negativo e todas as concentrações de TTO para exposição de 2 h e a partir da concentração de TTO 0.5% para as exposições de 60 s e 60 s com recuperação de 24 h. Ambos, controle positivo e CHX 0.12%, não apresentaram diferença estatistica (p>0.05). Conclusão: Apesar de apresentar baixo efeito antimicrobiano comparado a CHX 0.12%, o TTO mostrou ser capaz de reduzir o metabolismo de bactérias cariogênicas e não apresentar toxicidade em baixas concentrações e em curto tempo de exposição

ABSTRACT

Objective: The aim of this research, divided in two studies was to evaluate in vitro the effect of oil of Melaleuca alternifolia (TTO) against bacteria Streptococcus mutans (S. mutans) and Lactobacillus acidophilus (L.acidophillus) and its cytotoxic effect on keratinocyte cells (HaCat). Materials and Methods: In study 1, the antibacterial analysis was evaluated in 3 phases 1. Identification of MIC and MBC of TTO (0.25% to 2%) on the microorganisms in the planktonic form using the broth microdilution technique; 2. Analysis of cellular metabolism of microorganisms in SSB (monospecie biofilm) and DSB (multispecies biofilm) formed in cell culture plate and treated with different concentrations of TTO, using XTT assay; 3. Analysis of cellular metabolism of microorganisms in DSB formed on blocks of enamel and dentin and submitted to the following solutions 2% TTO, 0.12% chlorhexidine (positive control) or PBS (negative control) for 60 s, using XTT assay. Images obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM) were analyzed, too.. In study 2, the cytotoxic analysis of different concentrations of TTO was performed on HaCat cells at different contact times (60 s, 2 h, 60 s, with recovery of 24 h) was using the MTT assay to evaluate metabolic activity. The data showed non-normal distribution and therefore were used the nonparametric tests Kruskal-Wallis and Mann-Whitney. All statistical tests were considered at a significance level of 5%. Results: In the antibacterial analysis, for both S. mutans and L. acidophillus, the values of MIC and MBC were 0.5% and 1% respectively. The values of optical density (OD) for the bacterial metabolism, obtained by the XTT assay showed statistically significant for S. mutans SSB, at concentrations of TTO 0.25 to 2%, and for L. acidophillus SSB, at concentration of TTO 2% (p <0.05). However, there was no statistically significant difference in DSB (p> 0.05). When DSB on blocks of enamel and dentin were exposed to different solutions, the OD values showed statistically significant difference for the TTO 2% (p <0.05), but with less reduction of the metabolism than with CHX 0.12% (p <0.05). The images obtained by CLSM agree with the data from the XTT assay, indicating that the TTO has increased the number of dead bacteria on the surface of the blocks. In the analysis, of cytotoxity OD values or the cell metabolism, obtained by MTT test, showed significant differences (p <0.05) between the control and all concentrations of TTO for exposure of 2 h and for the concentrations between of 0.5% and 2% for TTO exposures of 60 s and 60 s to recovering 24 h. Both positive control and 0.12% CHX showed no statistical difference (p> 0.05). Conclusion: Although TTO results were not so good as the results with 0.12% CHX, TTO reduced the metabolism of cariogenic bacteria and presented low toxicity at low concentrations and in short exposition times