Efeito da deficiência de magnésio sobre o metabolismo do tecido ósseo / The effect of magnesium deficiency on bone metabolism

RESUMO

O magnésio (Mg+2) é um mineral que possui um importante papel na homeostase mineral, podendo afetar diretamente a função das células ósseas e a formação da hidroxiapatita. Entretanto, até o presente momento existem poucos estudos avaliando os mecanismos relacionados à alteração do metabolismo ósseo frente à deficiência de Mg. O objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, o efeito da deficiência de magnésio sobre a osteoclastogênese e atividade de osteoclastos. Também foi objetivo avaliar, in vivo, o efeito da deficiência de magnésio na dieta sobre o metabolismo ósseo, doença periodontal e tecido ósseo ao redor de implantes com osseointegração estabelecida. Para o estudo in vitro, foram avaliadas células indiferenciadas da medula óssea de ossos longos e mandíbula de camundongos. As células foram cultivadas em plástico e sobre tecido ósseo, em meios de cultura com diferentes concentrações de Mg (0.8 Mm que é considerada a quantidade adequada de Mg; e meios com redução do Mg, 0.4 Mm; 0.08 Mm; e 0 Mm). Após 3 dias de cultura, foram avaliadas a viabilidade celular, a taxa de proliferação celular e a expressão gênica, por PCR, de genes relacionadas à osteoclastogênese (c-fms, RANK, DC STAMP, c-fos, TNFα e IL-1ß) e ao metabolismo do Mg (TRPM-7 e MRS2). Após 6 dias de cultura, foram avaliados os parâmetros número de células osteoclásticas (coloração de TRACP), atividade (liberação de TRACP) e taxa de proliferação celular. Após 8 dias de cultura a atividade dos osteoclastos foi avaliada por análise de pit de reabsorção. Para o estudo in vivo, foram utilizados 30 ratos, divididos em 2 grupos grupo controle (CTL), que recebeu dieta com conteúdo adequado de magnésio, e grupo Mg, que recebeu dieta com redução de 90% da necessidade diária do mineral. Após um período de adequação ao ambiente do biotério, todos os animais foram submetidos à cirurgia de instalação de um implante na tíbia direita (dia 0). Decorrido um período de 60 dias, necessário à osseointegração dos implantes, os animais de cada grupo foram aleatoriamente divididos conforme a dieta que receberam (grupo CTL e grupo Mg). Após um período de 60 dias, todos os animais receberam uma ligadura no primeiro molar inferior esquerdo. Os animais foram sacrificados, com aprofundamento da anestesia, após um período de 150 dias do início do experimento. No dia do sacrifício foram coletadas amostras de sangue e urina, para avaliação das concentrações urinária de creatinina e deoxipiridinolina (DPD) e sérica de cálcio (Ca), magnésio (Mg), osteocalcina (OCN) e paratormônio (PTH). Para avaliação sistêmica foram realizadas análises de densitometria óssea (DEXA) do fêmur e vértebras lombares além da análise histológica do fêmur. Para avaliação do tecido mandibular foram realizadas análise da densidade radiográfica, análise histológica, análise macroscópica e PCR (RANKL, OPG e IL-6). E finalmente, para avaliação do tecido ósseo ao redor dos implantes foram realizadas análises de densidade radiográfica, torque de remoção e análise histométrica. Como resultados foram observadas, no experimento in vitro, um aumento na quantidade e tamanho dos osteoclastos, provenientes de ossos longos e mandíbula, quando cultivados em meio com deficiência de Mg. A maior quantidade de osteoclastos pode ser devido ao aumento na expressão gênica de c-fos, DC-STAMP, TNF-α e IL-1ß. Não houve alteração na viabilidade e taxa de proliferação celular na deficiência de Mg. Entretanto houve uma diminuição na atividade osteoclástica na deficiência de Mg. Os estudos in vivo demonstraram a deficiência de Mg resultou em diminuição da concentração sérica de Mg. Foi evidenciado que a deficiência do mineral teve uma influência negativa sobre o tecido ósseo, comprovada pela diminuição da densidade do fêmur e vértebras lombares, aumento na concentração de DPD e de PTH. Em análises específicas da mandíbula foi observada a diminuição na densidade radiográfica e o aumento na perda óssea alveolar relacionada à indução de doença periodontal. Nas análises específicas dos sítios de instalação dos implantes, apesar de não ter sido observada alteração na quantidade de tecido ósseo ao redor dos implantes, foi constatada a redução na espessura das corticais e diminuição nos valores de torque de remoção. Assim, dentro das limitações do estudo, pode-se concluir que a deficiência de Mg apresentou uma influência negativa sobre o metabolismo ósseo, agindo diretamente sobre a osteoclastogênese. A restrição de Mg resultou em perda de massa óssea sistêmica, bem como redução da resistência biomecânica dos implantes e perda óssea associada à doença periodontal induzida. Os resultados sugerem que a deficiência de Mg acentua a severidade da doença periodontal e influencia negativamente a manutenção de implantes com osseointegração estabelecida.

ABSTRACT

Magnesium (Mg) deficiency is very common condition in the world population. This mineral has an important role on bone homeostasis. However, there has been little research regarding the mechanisms in which magnesium deficiency alters bone metabolism. Also, the understanding of the factors associated to bone metabolism is of interesting for the prognosis of oral therapies, such as on periodontal disease and on osseointegrated dental implants. The aim of this study was to evaluate, in vitro, whether Mg deficiency affects the formation and/or activity of osteoclasts. And also to evaluate, in vivo, the effect of Mg intake deficiency on bone metabolism, periodontal disease and the bone tissue around osseointegrated implants. For the in vitro study, bone marrow cells from long bone and jaw of mice were seeded on plastic and on bone in medium containing different concentrations of Mg (0.8 mM which is 100% of the normal value, 0.4, 0.08 and 0 mM). The effect of Mg deficiency was evaluated on cell viability after 3 days and proliferation rate after 3 and 6 days, as was mRNA expression of osteoclastogenesis-related genes (M-CSF, RANK, c-fos, DC STAMP, TNF-α and IL-1ß) and Mg-related genes (TRPM7 and MRS2). After 6 days of incubation, the number of tartrate resistant acid phosphatase-positive multinucleated cells (TRACP+ -MNCs) was determined, and the TRACP activity of the medium was measured. Osteoclastic activity was assessed at 8 days by resorption pit analysis. For the in vivo studies, 30 rats received an implant in the right tibial metaphysis. After 60 days for healing of the implants, the animals were divided into groups according to the diet received. Control group (CTL) received a standard diet with adequate Mg content while test group (Mg) received the same diet except for a 90% reduction of magnesium. After 60 days of magnesium deficiency all animals received a ligature in the left lower first molar. The animals were sacrificed after 90 days of the start of the diet. It was evaluated calcium (Ca), magnesium (Mg), osteocalcin (OCN) and parathyroid hormone (PTH) serum levels and the deoxypyridinoline level (DPD) in the urine. The effect of magnesium deficiency on bone mineral density (BMD) was evaluated by densitometry of the lumbar vertebrae and femur and the histological analysis of the femur. The mandible BMD was assessed using digital radiography; alveolar bone loss was evaluated by linear (CEJ-bone crest) and area measurements. We used RT-PCR to assess mRNA expression (RANKL, OPG and IL-6) in the gingival tissues, and histological analysis was carried for the evaluation of inflammation, alveolar bone loss and for the number of osteoclasts. While the effect of bone tissue around titanium implants was evaluated by radiographic measurement of cortical bone thickness and BMD. The effect on biomechanical characteristics was verified by implant removal torque testing and the histometric analysis was carried out to evaluate the bone tissue around the osseointegrated implants. In vitro results showed that Mg deficiency resulted in increased numbers of osteoclast-like cells; a phenomenon found for both types of marrow. Mg deficiency had no effect on cell viability and proliferation. Increased osteoclastogenesis due to Mg deficiency was reflected in higher expression of osteoclast-related genes. However, resorptions per osteoclast, as well as TRACP activity were lower in the absence of Mg. The in vivo results showed that Mg deficiency was associated with higher concentrations of PTH, DPD and significant decreases on both systemic and mandibular BMD, but not around osseointegrated implants. There was a greater severity of alveolar bone loss, although there were no significant differences on mRNA expression for the target genes. Mg deficiency also resulted in decreased cortical bone thickness and lower values of removal torque of the implants. In vitro data suggest that altered osteoclast numbers and activity may contribute to the skeletal phenotype on magnesium deficiency. The in vivo study concluded that magnesium deficient diet had a negative influence on bone metabolism as well as on the severity of periodontal disease and on bone tissue around the implants