Diferenciação de osteoblastos cultivados sobre superfícies de titânio modificados por irradiação com laser Yb: YAG pulsado de alta potencia / Differentiation of osteoblasts cultured on titanium surfaces modified by Yb: YAG high energy pulsed laser

RESUMO

A osseointegração, requisito indispensável para o sucesso dos implantes dentários, é um processo lento, caracterizado, sequencialmente, pelas etapas de adesão, diferenciação e proliferação celular, bem como pela aposição e mineralização da matriz óssea depositada por osteoblastos. Acelerar o processo de osseointegração significa reduzir o tempo de espera para a aplicação segura de uma carga funcional sobre os implantes de titânio (Ti). Sabe-se que vários fatores, tal como a topografia da superfície do Ti, influenciam diretamente o processo de osseointegração. Assim, desde que foi demonstrado que alguns padrões específicos de superfície do Ti são capazes de bio-estimular osteoblastos, favorecendo e acelerando a osseointegração, diversas técnicas de baixo custo, rápida execução e altamente reproduzíveis, tem sido propostas para tratar a superfície dos implantes. Desta maneira, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar a capacidade de superfícies de Ti, modificadas com laser pulsado de alta potência (L) ou usinadas (U), de estimular a diferenciação e maturação de células obtidas de calvária de camundongos cultivadas sobre elas. Para isto, foram realizados ensaios laboratoriais para determinar a atividade mineralizadora das células (coloração com vermelho de alizarina e fosfatase alcalina), o metabolismo (MTT assay) e morfologia celular (MEV). A fim de melhor caracterizar a diferenciação de osteoblastos, foi realizada a reação de polimerização em cadeia (PCR) quantitativa em tempo real para analisar a expressão, pelas células cultivadas sobre as superfícies de Ti, de genes que codificam os fatores de transcrição Runx2 e Sp7 e proteínas específicas da matriz extracelular mineralizada (Spp1, Alpl, e Col1a1). Os dados numéricos obtidos foram submetidos a análise estatística. A superfície L foi capaz de aumentar a formação de nódulos de mineralização aos 14 dias em comparação com a superfície U (ensaio de vermelho de alizarina, p<0,05). Esta atividade mineralizadora, estimada também pela presença da enzima fosfatase alcalina, foi observada desde o período de 7 dias e se manteve até o dia 14. O ensaio de MTT revelou que esta maior capacidade mineralizadora não foi decorrente do aumento da proliferação celular, pois o metabolismo foi maior aos 14 dias em células cultivadas sobre a superfície U em comparação à superfície L (MTT assay, p<0,05). Os genes que codificam para fatores de transcrição estimuladores de diferenciação de osteoblastos (Runx2 e Sp7), assim como os genes que codificam para as proteínas osteopontina (Spp1), fosfatase alcalina (Alpl) e cadeia 1 do colágeno tipo 1 (Col1a1) foram aumentados no período entre 24 horas até os 14 dias em células cultivadas em contato com a superfície L. De acordo com a metodologia empregada neste estudo, foi possível concluir que a criação de topografias híbridas (micro, submicro e nano) com laser de alta potência bioestimula a diferenciação terminal de osteoblatos a partir de células obtidas de calvária de camundongos e acelera o processo biológico de síntese e mineralização de matriz óssea

ABSTRACT

The osseointegration, which plays a fundamental role in the dental implantation success, is characterized by cell adhesion, differentiation, proliferation as well as deposition and mineralization of of bone matriz by osteoblasts. To make the osseointegration process faster means reducing the period to apply a safe functional stress on the titanium (Ti) implants. A number of factors, such as the topographical surface of Ti enhances the osseointegration process. Different Ti surface treatments capable of bio-estimulating osteoblasts to accelerate the osseointegration have been evaluated. Current studies have shown that osseointegration of Ti devices is enhanced by surface roughness. In this way, the aim of the present investigation was to assess the capacity of Ti surfaces irradiated with high potency laser (L) or polished (U) to stimulate the differentiation and maturation of cells obtained from calvarian bone of mouse. Then, laboratorial protocols to evaluate the mineralizing cell activity (alizarin red assay), cell metabolism (MTT assay) as well as the morphology (SEM) of cells cultured on the Ti surfaces were carried out. To better characterize the osteoblast differentiation, the real time qPCR for expression of genes that code to the transcription factors Runx2 and Sp7 were performed. Additionaly, this protocol was also used to assess specific proteins of extracellular matrix (Spp1, Alpl, e Col1a1). The numeric data were subjected to statistical analysis. Our data demonstrated that the Ti surface L improved the osteoblast maturation capacity of calvarial osteoblasts grown over this surface. Scanning electron microscopy (SEM) revealed spheres and protrusions created by laser treatment. Laser profilometry showed a disordered surface with micrometric and/to nanometric scales features (Ra = 10.57µm). When compared to polished Ti (U), laser modified titanium (L) increased the nodule formation as well as the alkaline phosphatase (ALPase) activity at 7 and 14 days. These effects were not due to increased cell proliferation since no difference in metabolic activity on cells cultured over U and L surfaces after 1 and 3 days, and decreased activity after 7 days on L compared to U, as demonstrated by MTT assay. Relative quantification of gene expression (qPCR) revealed that transcription factors triggering osteoblast differentiation (Runx2 and Sp7) were up-regulated at 1, 3, 7 and 14 days on L surface. Genes encoding to the extracellular bone matrix proteins collagen type-1 (Col1a1) and osteopontin (Spp1) were also increased at 1, 3, 7 and 14 days. Alkaline phosphatase (Alpl) transcript was increased in osteoblasts after 3 an 14 days of culture on L surface as compared to M surface. Treatment of titanium with high power laser created a rough surface that stimulates osteoblast differentiation and maturation, which turn faster the biological process of synthesis and mineralization of bone matrix