Efeito da amoxicilina e do fluoreto no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos / Effect of amoxicillin and fluoride on enamel development in rat teeth

RESUMO

O uso da amoxicilina durante a primeira infância tem sido relacionado ao desenvolvimento de defeitos de esmalte denominados Hipomineralização Molar-Incisivo (HMI). Ademais, há relatos de possível potencialização dos efeitos do fluoreto no esmalte pela amoxicilina. Objetivo: A proposta do presente estudo foi avaliar o efeito da amoxicilina, e da associação amoxicilina com fluoreto no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos. Metodologia: O experimento foi dividido em três capítulos. Capítulo 1 - Quinze ratas prenhas (Rattus norvegicus, albinus, Holtzman) foram aleatoriamente distribuídas em três grupos que receberam, a cada 24 h, dose intragástrica de amoxicilina 100 mg/kg/dia (grupo GA100), amoxicilina 500 mg/kg/dia (grupo GA500) ou soro fisiológico (grupo GS), a partir do 130 dia de prenhez. Após o nascimento, doze filhotes de cada grupo receberam o mesmo tratamento das respectivas mães durante os períodos de 7 dias (n=6) e 12 dias (n=6) de vida. Após a eutanásia, as cabeças dos ratos foram removidas, fixadas e processadas para inclusão em parafina. Os cortes frontais da cabeça exibindo os primeiros molares superiores foram em parte corados com H&E e em parte submetidos à reação imuno-histoquímica para detecção de amelogenina e metaloproteinases da matriz-20 (MMP-20). Os cortes corados com H&E foram utilizados para análise morfológica e mensuração da espessura da camada de esmalte. A imunoexpressão para amelogenina e MMP-20 foram avaliados por análise semiquantitativa (H-score). Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste Tukey com nível de significância de 5%. Capítulo 2 - Quinze ratas prenhas (Rattus norvegicus, albinus, Holtzman) foram aleatoriamente distribuídas em três grupos, que receberam, amoxicilina 100 mg/kg/dia (grupo GA100), amoxicilina 500 mg/kg/dia (grupo GA500) ou soro fisiológico (grupo GS), conforme descrito no capítulo 1. Após o nascimento, dez filhotes por grupo receberam o mesmo tratamento do 10 ao 400 dia de vida. Aos 40 dias, os animais sofreram eutanásia, os incisivos e molares foram extraídos, e submetidos às análise do conteúdo de cálcio, pelo método de titulação com EDTA, de fósforo por método colorimétrico usando espectrofotômetro. E a densidade eletrônica do esmalte nos primeiros molares foi analisada pela tomografia micro-computadorizada (XRM). Capítulo 3 - Quarenta ratos foram distribuídos, aleatoriamente, em quatro grupos, expostos ao fluoreto na água (100 ppm (mg F/L) ou à administração intragástrica de amoxicilina (500 mg/Kg peso), segundo as combinações grupo controle (GS); grupo amoxicilina (GA), grupo fluoreto (GF) e grupo amoxicilina com fluoreto (GA+F). Após 60 dias, amostras de plasma e uma tíbia foram coletados e analisados quanto a concentração de fluoreto por meio de eletrodo de íon seletivo. Os incisivos foram submetidos à quantificação do grau de fluorose (por um software de análise de imagens, Dental fluorosis by Image Analysis ­ DFIA), a análise de conteúdo de cálcio, pelo método de titulação com EDTA, de fósforo por método colorimétrico usando espectrofotômetro, e determinações da espessura do esmalte e de sua microdureza. Resultados: Capítulo 1 - Aos 7 dias, diversas estruturas vacuolares foram observadas na porção citoplasmática distal dos ameloblastos dos ratos dos grupos GA100 e GA500; além disso, a espessura do esmalte foi significantemente menor nos grupos GA100 e GA500 quando comparado ao GS (p<0,001). Em contraposição, diferenças estatisticamente significantes não foram observadas entre os grupos no período de 12 dias (p=0,111). Diferenças entre os grupos também não foram observadas na intensidade de imunomarcação exibida pelos ameloblastos à anti-amelogenina (p=0,818) e à anti-MMP-20 (p=0,855). Capítulo 2 - Não foram observadas diferenças estatisticamente significante no conteúdo de cálcio (p=0,180), fósforo (p=0,054) e densidade eletrônica (p=0,150) entre os grupos. Capítulo 3 - Observou-se que a espessura do esmalte (p=0,228) e a concentração de cálcio (p=0,592) e fósforo (p=0,409) nos incisivos não diferiram estatisticamente entre os grupos. No entanto, a concentração de fluoreto nos tecidos dentário, ósseo e plasma foi maior nos grupos expostos em GF e GA+F (p<0.001). A análise fotográfica pelo índice DFIA e a microdureza mostraram diferenças significativas entre os grupos (p<0.001), sendo que GF apresentou maior severidade de hipomineralização do esmalte, seguido por GA+F e GA. Houve um aumento linear na dureza do esmalte quando nas profundidades de 10 µm a 30 µm, sendo esse aumento entre 4 a 5 KHN por µm de profundidade nos GA+F e GF, e entre a 7 a 8 KHN por µm nos grupos GA e GS. Os achados desse estudo mostraram que os animais expostos cronicamente ao fluoreto desenvolveram hipomineralização de esmalte, e a associação da amoxicilina não potencializou a severidade da hipomineralização. Conclusão: Capítulo 1 - Conclui-se que a amoxicilina pode provocar alterações durante a amelogênese, as alterações foram observadas no estágio secretor da matriz do esmalte, sugerindo atraso na aposição de matriz do esmalte. Capítulo 2 - Conclui-se que a amoxicilina não influenciou o conteúdo mineral dos incisivos e molares de ratos. Capítulo 3 - Concluímos que a amoxicilina não influenciou o desenvolvimento do esmalte, bem como não potencializou o efeito do fluoreto

ABSTRACT

Background: Amoxicillin use in early childhood has been associated with molarincisor hypomineralization. Moreover, it has been supposed an association between amoxicillin and fluoride on enamel defects. Aim. This study aimed to evaluate in vivo the effect of amoxicillin and amoxicillin associated with fluoride on the enamel development of rat tooth. Materials and Methods: The research was divided into three studies. Chapter 1 ­ Fifteen pregnant Holtzman rats (Rattus norvegicus albinus) were divided randomly into three groups to receive saline (SG), 100 mg/kg/day amoxicillin (A100G), or 500 mg/kg/day amoxicillin (A500G), intragastrically, from days 13 to 22 of pregnancy. Twelve offsprings per group got the same dose until day 12. After 7 and 12 days, the specimens were fixed and embedded in paraffin. In the HEstained sections, the thickness of enamel matrix of upper molar germs was evaluated. Moreover, detection of amelogenin on day 7 and matrix metalloproteinase 20 (MMP -20) on day 12 by immunohistochemistry were carried out. Chapter 2 - Fifteen rats (Rattus norvegicus, Albinus,Holtzman) were randomly divided into three groups to receive saline (SG), 100 mg/kg/day amoxicillin (A100G), or 500 mg/kg/day amoxicillin (A500G), as described in Chapter 1. Ten offspring per group received the same dose until day 40. The animals were euthanized on day 40. A total of 60 upper incisors and 60 upper first molars from 30 animals were dissected. Calcium (Ca) determination was performed by the compleximetric titration method and phosphorus (Pi) determination by colorimetric analysis using a spectrophotometer at 680 nm. A total of 30 lower first molars from 15 animals were analyzed under X-ray microtomography (XMT). Chapter 3 - Forty rats were, randomly, divided into four groups exposed to fluoride in water (100 ppm (mg F/L) or intragastric administration of amoxicillin (500 mg /kg body weight), according to the combinations control group (SG); amoxicillin group (AG), fluoride group (FG) and amoxicillin with fluoride group (A+FG.) After 60 days, the animals were euthanized. The concentrations of fluoride in the plasma, tibia and incisors of the rats were determined. The incisors were also analysed by the fluorosis severity (by software image analysis, Dental fluorosis by Image analysis - DFIA), calcium content by compleximetric titration method and phosphorus content by colorimetric method, enamel thickness, and its hardness. Results: Chapter 1 - A100G and A500G groups showed lower thickness of the enamel matrix than GS (p<0.001) on day 7, but not on day 12 (p=0.111). On day 7, the treated groups showed morphological changes in ameloblasts, represented by vacuoles. The amelogenin (p=0.818) and MMP20 (p=0.855) immunostaining intensity did not differ among groups. Chapter 2 - There were no statistically significant differences in Ca content (p=0.180), Pi content (p=0.054), or XMT electron density (p=0.150) among the groups. Chapter 3 - The thickness of the enamel (p=0.228), Ca content (p= 0.592) and Pi content (p=0.409) were not statistically different among the groups. However, the concentration of fluoride in the tooth, bone, and plasma was higher in the FG and A+FG (p< 0.001) than AG and SG. The DFIA index and microhardness showed significant differences among groups (p<0.001), and FG presented greater severity hypomineralization enamel than SG, followed by A+FG and AG. The hardness increased linearly in the 10 µm a 30 µm depths, being from 4 to 5 KHN per mm in depth in the AG and A+FG, and from 7 to 8 KHN mm in depth in the AG and SG. The findings of this study showed that animals chronically exposed to fluoride developed enamel hypomineralization, and the association of amoxicillin had no role in the hypomineralization severity. Conclusion: Chapter 1 - Amoxicillin can cause changes only during secretory stage, suggesting a delay in ameloblasts differentiation. Chapter 2 ­ Amoxicillin did not affect the mineral content and electron density of rat teeth. Chapter 3 ­ Amoxicillin did not influence the development of the enamel, and did not potentiate the effect of fluoride