Contribuição para o desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose visceral canina / Contribution to the development of a vaccine against canine visceral leishmaniasis

RESUMO

A Leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa e parasitária que se encontra em expansão no Brasil. A espécie que causa a doença no Brasil é a Leishmania infantum. O cão é o principal reservatório do parasita. Uma vacina contra leishmaniose visceral canina (LVC) pode favorecer o controle da doença. Este trabalho tem como objetivo contribuir para o desenvolvimento de uma vacina contra LVC.OBJETIVO: O estudo do primeiro capítulo visou o desenvolvimento de um modelo para a avaliação de antígenos candidatos à vacina contra LVC. METODOLOGIA: Um experimento foi realizado para obtenção de cães resistentes a LVC. Os linfócitos dos animais deveriam ser capazes de reconhecer antígenos otencialmente úteis para o desenvolvimento de uma vacina. Para isso, uma cepa de L.infantum foi isolada de cão naturalmente infectado e doente (Camaçari, Bahia). Seis cães adultos e sadios foram inoculados com 1x108 formas promastigotas em fase estacionária de cultura por via dérmica e acompanhados por dois anos.RESULTADOS: Os animais apresentaram 1) área de induração e ulceração rasa no local da inoculação do parasita com cura espontânea em um período inferior a três meses, 2) ausência de manifestações clínicas e de alterações hematológicas e bioquímicas séricas, 3) produção baixa e flutuante de anticorpos da classe IgG reativos a antígenos de Leishmania, 4) resposta linfoproliferativa (em 4 de 6 cães) frente a estimulação com antígenos de Leishmania, 5)produção baixa de IFN-γ em um ensaio realizado com sangue total incubado por 24h com antígenos de Leishmania (4 de 5 cães), 6) carga parasitária baixa em aspirado de baço,detectada por PCR em tempo real. CONCLUSÃO: Os animais desenvolveram uma forma subclínica da infecção ao lado de resposta imune humoral e celular fracas.OBJETIVO: No segundo capítulo foi testado um ensaio de avaliação da produção de citocinas por células de sangue de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum. O quantiFERON modificado permite a avaliação in vitro e de maneira rápida da produção de citocinas contra Leishmania em animais de área endêmica. METODOLOGIA: Antígeno solúvel e antígenos recombinantes de L. infantum (rLci2-NT-5R-CT e rLci2-NT-CT) foram produzidos e utilizados no ensaio para a estimulação do sangue total de27 cães de área endêmica e não endêmica para LVC por 24h. O plasma foi coletado e a produção das citocinas caninas IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF-α foram quantificadas. RESULTADO:Devido a problemas técnicos não foi possível avaliar os dados obtidos e,consequentemente,não foi possível caracterizar grupos de animais susceptíveis e resistentes.OBJETIVO: No terceiro capítulo, a carga parasitária e aspectos histológicos em diferentes regiões do baço de cães com LVC foi analisada.METODOLOGIA: A carga parasitária e alterações histológicas no baço de 6 cães com LVC foram avaliados por amostragem de três secções inferior, média e superior do órgão...

ABSTRACT

INTRODUCTION: Visceral Leishmaniasis (VL) is an infectious parasitic disease which is increasing in Brazil. The species that causes the disease in Brazil is Leishmaniainfantum. The dog is the main reservoir of the parasite. A canine visceral leishmaniasis vaccine (CVL) may favor the control of the disease. This paper aims to contribute to the development of a vaccine against CVL. OBJECTIVE: The first chapter study aimed the development of a model for the evaluation of candidate antigens for a vaccine against CVL. An experiment was conducted to obtain resistant dogs to CVL. Lymphocytes of these animals should be able to recognize potentially useful antigens for a vaccine development. METHODOLOGY: For this, a strain of L. infantum was isolated from naturally infected and sick dog (Camaçari, Bahia). Six dogs and healthy adults were intradermally inoculated with 1 x 108 promastigotes in the stationary phase culture and were followed for two years. RESULTS: The animals showed 1) induration area and shallow ulceration in parasite inoculation site with spontaneous healing in a period of less than three months, 2) absence of clinical symptoms and hematological and biochemical changes, 3) low and floating production of antibodies IgG reactive to Leishmania antigens, 4) lymphoproliferative response (in 4 of 6 dogs) compared to stimulation with leishmanial antigens, 5) low IFN-γ in a test performed on whole blood incubated for 24 h with antigen Leishmania (4 of 5 dogs), 6) a low parasite load in spleen aspirates, detected by realtime PCR. CONCLUSION: These animals developed a subclinical form of the infection alongside with a weakspecific humoral and cellular immune response and weak cell. OBJECTIVE: The second section was tested in a trial evaluating cytokine production by blood cells of dogs naturally infected with Leishmaniainfantum. The modified QuantiFERON allows evaluation both in vitro and quickly production of cytokines against Leishmania in animals in an endemic area. METHODOLOGY: Soluble antigen and recombinant antigens of L. infantum (rLci2-5R-NT-CT and rLci2-NT-CT) were produced and used in the assay for the stimulation of whole blood of 27 animals from endemic and nonendemic area for LVC for 24h. Plasma was collected and cytokine production of canine IFNγ, IL-2, IL-6, IL-10 and TNF-α cytokines were quantified. RESULTS: Due to technical some problems, it was not possible to characterize groups of animals susceptible and resistant in relation to modified QuantiFERON assay results. OBJECTIVE: In the third chapter, the parasite load and histological aspects in different regions of the spleen of dogs with CVL were analyzed. METHODOLOGY: The parasite load and histological changes in the spleen of 6 dogs with CVL were evaluated by sampling three sections of the spleen (lower, middle and upper section of the organ)...