Produção e avaliação do receptor solúvel de IL-10 canina recombinate / Production and evaluation of the soluble receptor of IL-10 Canine recombinant

RESUMO

A interleucina 10 (IL-10) é uma importante citocina anti-inflamatória e imunossupressora que é produzida por uma variedade de células do sistema imune, incluindo linfócitos T e B, células monocíticas, células Natural Killer, células dendríticas, eosinófilos e neutrófilos. O receptor de IL-10 é composto por duas cadeias polipeptídicas denominadas IL-10R1 e IL-10R2. A cadeia IL-10R1 exibe alta afinidade por IL-10 e é responsável pela ligação inicial com a citocina. Depois da ligação entre a IL-10 e a cadeia IL-10R1, a cadeia IL-10R2 se junta ao complexo protéico formado e é realizada a sinalização para o citoplasma da célula alvo. Existem evidências de que a IL-10 participa na susceptibilidade de seres humanos e cães a leishmaniose visceral. Além disso, a imunização de animais com antígenos e o bloqueio concomitante da sinalização por IL-10 pode favorecer a indução de respostas imunes celulares (Th1), úteis no combate a infecções por patógenos intracelulares.OBJETIVO: O objetivo do presente projeto foi produzir o receptor solúvel de IL-10 (domínio extracitoplasmático da cadeia IL-10R1, com atividade antagonista) recombinante (rcasIL-10R1), visando estudos futuros de imunomodulação em cães. METODOLOGIA: Para isso, foram realizadas as seguintes etapas 1) obtenção de uma construção de DNA codificante de rcasIL-10R1 em um cromossoma artificial de baculovírus desprovido dos genes da catepsina e chitinase, 2) transfecção de células de insetos, obtenção de partículas virais e titulação viral (P1), 3) amplificação e titulação viral (P2), 4) ensaio de otimização para expressão da proteína recombinante em células High five; 5) produção da proteína recombinante em celulas High five e purificação por cromatografia de afinidade e 6) avaliação da capacidade de rcasIL-10R1 bloquear a sinalização de IL-10, utilizando-se células MC/9. RESULTADOS: A julgar pelo sequenciamento de DNA do inserto na construção plasmídeal carreadora (pFastBac1-GP64-casIL-10R1) e da amplificação por PCR do segmento de DNA contendo o inserto no cromossoma artificial do baculovírus, a obtenção de baculovírus recombinante codificando casIL-10R1 foi realizada com sucesso. O ensaio de otimização da produção da rcasIL-10R1 realizado com células de inseto da linhagem High Five mostrou as melhores condições para foram multiplicidade de infecção (MOI) 5 e tempo de infecção (TOI) de 72h. A proteína recombinante produzida e purificada mostrou uma banda principal de 42 kDa pela análise por eletroforese em gel de poliacrilamida e o rendimento foi de 2,8 mg por litro de cultura. O ensaio realizado com células MC/9 cultivadas na presença de IL-4 e IL-10 com ou sem rcasIL-10R1 mostrou que a proteína recombinante produzida inibiu parcialmente a proliferação das células, sugerindo o bloqueio da sinalização através de IL-10. CONCLUSÕES: Portanto, no presente trabalho rcasIL-10R1 com capacidade de bloquear a sinalização por IL-10 foi produzido com sucesso, abrindo a perspectiva de futuros estudos de imunomodulação em cães.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Interleukin 10 (IL-10) is an important anti-inflammatory and immunosuppressive cytokine which is produced by a variety of immune cells, including T and B lymphocytes, monocytes, natural killer and dendritic cells, eosinophils and neutrophils. The IL-10 receptor is composed of two polypeptide chains called IL-10R1 and IL-10R2. IL-10R1 chain exhibits high affinity for IL-10 and is responsible for initial binding to the cytokine. After IL-10 binding to IL-10R1, IL-10R2 joins the protein complex formed and signaling to the cytoplasm of the target cell. There is evidence that IL-10 participates in the susceptibility of human and dog visceral leishmaniasis. Furthermore, immunization of animals with antigens and concomitant blockade of signaling by IL-10 may promote the induction of cellular immune responses (Th1), useful in combating infections caused by intracellular pathogens. OBJECTIVE: The objective of this project was to produce recombinant soluble receptor IL 10 (extracytoplasmic domain of IL-10R1 chain, with antagonist activity) (rcasIL10R1), aiming future studies of immunomodulation in dogs. METHODOLOGY: For this, the following steps were carried out 1) obtaining a DNA construction encoding casIL-10R1 in an artificial chromosome baculovirus knockout of the cathepsin and chitinase genes, 2) insect cell transfection, obtaining viral particles and viral titration (P1) 3) amplification and viral titration (P2), 4) optimization assay for the recombinant protein production in High Five cells; 5) production of recombinant protein and purification and by affinity chromatography and 6) evaluation of rcasIL-10R1 ability to block IL-10 signaling, using MC / 9 cells. RESULTS: The results of DNA sequencing of shuttle plasmid construction (pFastBac1GP64-casIL-10R1) and PCR of the artificial chromosome baculovírus containing casIL-10R1 insert showed that recombinant baculovirus was successfully obtained. The rcasIL-10R1 expression optimization assay in High Five cells showed that the best conditions were multiplicity of infection (MOI) 5 and time of infection (TOI) 72 h. The recombinant protein produced and purified displayed a major band of 42 kDa by polyacrylamide gel electrophoresis and the yield was 2.8 mg per liter of culture. MC/9 cells cultured in presence of IL-4 and IL-10 proliferated less intensely when rcasIL-10R1 was added, suggesting that rcasIL-10R1 blocked IL-10 signaling...