Nueva reacción en cadena de la polimerasa múltiple para el diagnóstico específico de especies implicadas en la candidiasis humana / A new multiplex PCR for species-specific diagnosis of human candidiasis

RESUMEN

RESUMEN Introducción. Las candidiasis son un grupo de infecciones oportunistas causadas por levaduras del género Candida. Candida albicans es la especie de mayor prevalencia en las infecciones superficiales y profundas. Sin embargo, en la última década, la frecuencia de especies diferentes a C. albicans ha aumentado y, por ende, su relevancia clínica, lo cual exige la utilización de técnicas diagnósticas que permitan su detección y el tratamiento adecuado de los pacientes afectados. Objetivo. Diseñar y optimizar una técnica de reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR múltiple) considerando parámetros termodinámicos para la detección simultánea de cinco especies de Candida relevantes en la etiología de la candidiasis humana. Materiales y métodos. Para el diseño de los cebadores se consideraron restricciones físicas y termodinámicas que afectan la PCR múltiple, usando el programa Gene Runner y la herramienta Mult-PSOS. Como plantillas se utilizaron la región transcrita interna 2 (ITS2) (AJ249486.1) para C. albicans y la topoisomerasa II (TOPII) para C. parasilopsis (AB049144.1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (AB049141.1) y C. guillermondii (AB049145.1), y como moldes, extractos de ADN total obtenidos de cepas ATCC y de aislamientos clínicos de las especies de Candida. Resultados. Se diseñaron diez cebadores para la amplificación simultánea de las especies de Candida. Se obtuvo el siguiente patrón de bandas C. albicans (206 pb), C. guillermondii (244 pb), C. tropicalis (474 pb), C. parasilopsis (558 pb) y C. krusei (419 pb). Conclusión. El ensayo diseñado de PCR múltiple permitió la amplificación simultánea y eficiente de todos los amplicones correspondientes a las especies estudiadas de Candida, así como su adecuada resolución en gel de agarosa al 1,3 %.

ABSTRACT

ABSTRACT Introduction: Candidiases is a group of opportunistic infections caused by yeasts belonging to the genus Candida. Candida albicans is the most prevalent species in both superficial and deep infections, however, the clinical importance of non-albicans Candida has increased during the last decade, driving an urgent need for diagnostic tests that allow for species-level resolution and selection of the optimum therapeutic approach. Objective: To design and to optimize a new multiplex PCR assay for the simultaneous identification of the five most relevant species of Candida involved in human candidiasis etiology. Materials and methods: For primers design, the physical and thermodynamic restrictions that affect multiplex PCR performance were analyzed using Gene Runner and Mult-PSOS. As templates, the internal transcribed region 2 (ITR2) was selected for C. albicans (AJ249486.1), and topoisomerase II (TOPII) for C. parasilopsis (AB049144.1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (AB049141.1), and C. guillermondii (AB049145.1). We used ATCC strains of all these five species and clinical isolates as templates. Results: We designed ten oligonucleotides for the simultaneous amplification of the Candida species. The electrophoresis band profile was C. albicans (206 bp), C. guillermondii (244 bp), C. tropicalis (474 bp), C. parasilopsis (558 bp), and C. krusei (419 bp). Conclusion: The new multiplex PCR assay designed in this study allowed a simultaneous and efficient amplification of the amplicons corresponding to the five species of Candida under study, with an adequate resolution in standard agarose gel.