Detecção da bactéria Wolbachia em insetos através da técnica LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop)

RESUMO

Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel)foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente)e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco.