Avaliação do papel de BCCIP na via de reparo de dano ao DNA: sua associação a BRCA1 E BARD1 / Assessment of the role of BCCIP in the DNA damage repair pathway: association with BRCA1 and BARD1

RESUMO

BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1) foi identificada originalmente como uma proteína de interação de BRCA1 (breast cancer 1, early onset) através de ensaio de dois híbridos em levedura (Y2H). Foi descrito que a formação do heterodímero BRCA1/BARD1 éessencial para que BRCA1 exerça sua função supressora de tumor. Ambas as proteínas interagem através de seus domínios RING N-terminais para formar o heterodímero BRCA1/BARD1 com atividade E3 ubiquina ligase, o que constitui a principal atividade catalítica deste complexo. A porção C-terminal de BRCA1 contém dois domínios BRCT em tandem (tBRCT), característicos de uma grande família de proteínas envolvidas no controle da estabilidade genômica. Esses domínios tBRCT medeiam a associação com uma plêiade de proteínas com papel importante no controle do reparo de dano ao DNA (RDD), transcrição gênica e ciclo celular. A fim de identificar novas proteínas de interação com BARD1 foi realizado Y2H utilizando o tBRCT (554-777aa) de BARD1 e uma biblioteca de cDNA de testículo humano. Como resultado, foi identificado, dentre outras proteínas, o cDNA que codifica para a porção C-terminal de BCCIP (BRCA2 and CDKN1A Interacting Protein) (240-322aa). BCCIP foi descrito por seu envolvimento em vias de RDD e controle do ciclo celular. BCCIP interage com BRCA2 e ambas são importantes para a formação defoco de RAD51 após o dano por radiação ionizante. BCCIP interage com p21, potencializando a inibição de CDK2, além de regular a atividade transcricional de p53 na região promotora de p21...

ABSTRACT

BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1) was originally identified in a yeast-two-hybrid (Y2H) screen as a binding partner of BRCA1 (breast cancer 1, early onset). The functional heterodimer BRCA1/BARD1 is required for several of the cellular and tumor-suppressorfunctions of BRCA1. Both proteins interact through the N-terminal RING domain to form aheterodimeric E3 ubiquitin ligase that constitutes the major catalytic activity of the BRCA1-BARD1 complex. The carboxy terminus of BRCA1 is highly acidic and contains two tandemBRCA1 C-terminal (tBRCT) domains, which are characteristic of members of a large familyof proteins involved in genome stability. These domains are protein-protein interactingregions that mediate the association with a number of other proteins with a role in DNAreplication, DNA damage repair (DDR) pathway, transcription and cell cycle control. In orderto identify putative interaction-proteins with BARD1 C-terminal region our group performed aY2H assay using BARD1 tBRCT (aa 554-777) to screen a human testis cDNA library. Asresult, we identified, among other hits, a cDNA coding for BCCIP (BRCA2 and CDKN1 Ainteracting protein) C-terminal region, residues 240-322. BCCIP is known for its involvementin DDR and cell cycle control. BCCIP interacts with BRCA2, and both proteins are importantfor RAD51 focus formation after ionizing radiation and homologous recombination (HR)repair of double-strand-breaks (DSBs). BCCIP enhances the p21 suppression activitytowards CDK2 and its downregulation reduces p21 expression by abrogating p53transcription activity. The aim of this study is to analyze the role of BCCIP in the DDRpathway. We confirmed the BARD1/BCCIP interaction by pull-down and co-immunoprecipitation (co-IP) analyzes of ectopically expressed BARD1 and BCCIP...