Diversidade de metilação no DNA de HPV16 e HPV18 em carcinomas cervicais invasivos / Diversity of hpv16 and hpv18 dna methylation in invasive cervical carcinomas

RESUMO

A metilação de citosinas em sítios CpG é uma das principais modificações epigenéticas e está frequentemente associada à repressão transcricional. Apesar de estudos demonstrarem que o promotor dos oncogenes E6/E7 apresenta modulação através da metilação e que existe aumento progressivo nos níveis de metilação em sítios CpG específicos durante a progressão do câncer cervical, pouco se sabe sobre o papel da metilação na regulação da transcrição viral e como características clínicas e biológicas do carcinoma cervical invasivo podem influenciar a metilação. O objetivo principal do trabalho foi caracterizar, em amostras de tumores cervicais invasivos, a diversidade dos níveis de metilação em sítios CpG presentes na LCR, L2 e L1 de HPV16 e HPV18. Os objetivos específicos: (i) caracterizar os níveis de metilação em sítios CpG na LCR de HPV16 e HPV18 por pirosequenciamento; (ii) caracterizar os níveis de metilação em sítios CpG na LCR, L2 e L1 de HPV16 e HPV18 por NGS; (iii) associar os níveis de metilação às características clínicas e biológicas da doença; e (iv) caracterização dos haplótipos de metilação de HPV16 e HPV18. As amostras foram obtidas de pacientes atendidas no ambulatório do INCA e diagnosticadas com câncer cervical invasivo. Foram selecionadas 229 amostras, sendo 165 infectadas com HPV16 e 64 com HPV18. PCR combinando iniciadores para os genes E1/E2 dos HPVs 16 e 18 foi utilizada para avaliar o estado físico do DNA viral. Os níveis de metilação foram determinados por conversão por bissulfito sódio das amostras de DNA, seguido de amplificação da região de interesse, LCR, L2 e L1, e análise por pirosequencimamento ou NGS. Informações clínicas e biológicas da doença foram extraídas de questionários, banco de dados e estudos prévios. Foram observados maiores níveis de metilação em sítios CpG presentes em L2 e L1 de HPV16 e HPV18 quando comparados à LCR...

ABSTRACT

DNA methylation plays one of the most important epigenetic modifications and often leads to repression of transcription. Despite studies that show oncogene promoters of HPV16 (P97) being modulated by methylation and that methylation in specific CpG sites is related to severity of cervical neoplasia, it is still unclear how methylation contributes to the viral transcription and how clinical and biological factors related with HPV can affect the methylation pattern in invasive cervical cancer (ICC). The main goal was to characterize diversity of methylation level in CpG sites of LCR, L2 and L1 of HPV16 and HPV18 in invasive cervical cancer samples. Specific goals: (i) characterize level of methylation in CpG sites at LCR of HPV16 and HPV18 by pyrosequencing; (ii) characterize level of methylation in CpG sites at LCR, L2 and L1 of HPV16 and HPV18 by NGS; (iii) associate level of methylation with clinical and biological tumor characteristics; and (iv) characterize the methylation haplotype of HPV16 and HPV18. The 229 selected samples, being 165 with HPV16 and 64 with HPV18, were obtained from biopsies of patients attended at INCA ambulatory and diagnosed with invasive cervical cancer (ICC). Level of methylation was assessed by means of bisulfite treatment followed by PCR and pyrosequencing or NGS. PCR combining pairs of primers was performed to assess integrity of E1 and E2 genes for HPV16 and HPV18. CaSki and HeLa cell lines were used as methylation control. Patient and clinical information were obtained from questionnaires, database and previous studies. The methylation level was higher in L2 and L1 CpG sites of HPV16 and HPV18 DNA in comparison with LCR...