Programando o software Imagej para a seleção automática de áreas marcadas por imuno-histoquímica e coradas com o cromógeno dab e contra-coradas pela hematoxilina / Programming Imagej software for automatic selection of immunohistochemistry marked areas stained by dab chromogen and counter-stained by hematoxylin

RESUMO

Introdução: A quantificação dos parâmetros de imunomarcação na análise de imagens de imuno-histoquímica depende da adequada delimitação das regiões marcadas, sendo a seleção destas regiões realizada manualmente ou através de métodos computacionais automáticos ou semi-automáticos. Objetivos: Viabilizar um método de seleção automática de áreas marcadas por imuno-histoquímica por meio do software ImageJ, apresentando a programação envolvida e analisando quantitativamente as imagens. Métodos: Para a aplicação e avaliação da programação proposta neste trabalho foram utilizadas imagens de imuno-histoquímica para localização de alfa-actina de músculo liso (α-SMA) provenientes de estudo de modelo animal experimental de fibrose renal em ratos Wistar machos. Foram capturadas imagens de áreas distintas da região do córtex renal contendo regiões positivas coradas pelo 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) em uma lâmina com imunomarcação extensa (n=10) e em outra lâmina com Imunomarcação focal (n=10), provenientes de dois animais. A contra-coloração foi feita com hematoxilina. Resultados: A diferença da extensão da imunomarcação foi qualitativamente evidente entre os dois grupos de imagens. As áreas reveladas pelo DAB nas lâminas dos animais I e II foram selecionadas automaticamente pelo programa, ajustadas pelo operador, e quantificadas, apresentando fração de área ocupada de 23,48 ± 6,52% e de 0,10 ± 0,04% respectivamente, valores expressos em média ± desvio padrão com diferença estatística significativa (p < 0,0001).Conclusões: O software ImageJ mostrou-se adequado para a aplicação da seleção automática de áreas marcadas por imuno-histoquímica, embora a intervenção do operador tenha sido necessária para a correta identificação dos pontos de corte do "threshold", supervisionando a correta delimitação das áreas.

ABSTRACT

Introduction: The immunostaining quantitative parameters of immunohistochemistry image analysis depend on the proper delimitation of marked regions. The selection of those marked regions is carried out manually, or by computed semi-automatic or automatic methods.Objectives: to carry out a feasible automatic method on selection of immunohistochemistry stained areas applying the Image J software (NIH), presenting the computed program and the quantitative analysis of some images.Methods: For application and evaluation of the proposed program of the study, we used immunehistochemistry images of alpha-smooth muscle actin (α-SMA), a marker of epithelial dedifferentiation, coming from an experimental study of renal fibrosis in Wistar male rats. The images have been captured from non-overlapping regions of the renal cortex, comprising positive 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)-stained fields of a strong immunostained slide (N=10, animal I) and another slide with focal immune pattern (N=10, animal II), obtained from two different animals. The slides were counter-stained by Hematoxylin.Results: The difference by immunostaning between the two specimens was qualitatively evident. The areas revealed as DAB-positive in animals I and II slides were automatically selected by the proposed program, visually adjusted by the operator, and finally, quantified, resulting in an occupied area fraction of 23.48 ± 6.52% and 0.10 ± 0.04%, respectively, p<0.0001. Conclusion: The software Image J was able to perform a feasible automatic selection of immunohistochemistry DAB stained areas, although the operator intervention has been necessary to identify the correct threshold cut-off points, supervising if the delimitation of marked areas was precise.