Estrutura e propriedades de inibidores de serinoproteinases do tipo Bowman-Birk de sementes de Dioclea glabra e do tipo Kunitz de sementes de Bauhinia rufa / Structure and proprieties of Bowman-Birk serine proteases inibitors from Dioclea glabra seeds and Kunitz serine proteases inhibitors from Bauhinia rufa

RESUMO

Dioclea glabra é uma leguminosa da subfamília Papilionoideae, encontrada em todo o Brasil. A presença, em suas sementes, de uma proteinase (dioclen) e de um específico inibidor de tripsina, já foi por nós previamente descrito (Bueno 1994). O inibidor foi purificado das sementes de Dioclea glabra por precipitaçao por acetona, fracionamento em troca iônica e filtraçao em gel. A estrutura primária do ínibidor, determinada por degradaçao de Edman e espectrometria de massa, indicou que o inibidor de tripsina pertence à família de inibidores Bowman-Birk, contém 67 resíduos de aminoácidos e é o primeiro inibidor caracterizado e preparado da tribo Díoclea SSGPCCDRCRCTKSEPPQCQCQDVRLNSCHSACEACVCSHSMPGLCSC LDITHFCHEPCKSSGDDED Embora o inibidor apresente dois sítios reativos determinados por clivagem específica por tripsina (Lys 13 His4o), foi demonstrado que apenas o primeiro sítio, com Lys 13 em Pl, se mostrou efetivo. DgTI forma complexo 11 com tripsina, com constante de dissociaçao Ki O,5 x lO-9 M; e nao foi observada inibiçao para quimotripsina, calicreínas, plasmina e trombina. Apesar da alta especificidade para a tripsina, DgTI também inibiu a atividade proteolítica de Musca domestica (Diptera) e Tenebrío molitor (Coleoptera). As características estruturais e inibitórias do DgTI nos permitem classifica-lo como o primeiro inibidor de Bowman-Birk tipo I descrito para dicotiledôneas. Dioclen é uma endoproteinase com massa molecular de aproximadamente 60 kDa e que criva Arg na posiçao Pl. Embora sua açao dependa da presença metais, as inibiçoes por TPCK, TLCK e DFP permitem caracterizar a enzima tentativamente como membro da família de serinoproteinases. Dioclen hidrolisa proteínas nativas das sementes de Dioclea glabra, inclusive o inibidor DgTI; n entanto, a enzima nao é afetada por esse inibidor. Neste trabalho também foram caracterizados 2 inibidores com massa molecular de aproximadamente 20 kDa, das sementes de Bauhinia rufa. A proteínas apresentaram diferentes especificidades para a inibiçao das serinoproteinases. BrTI-l e BrTI-3 foram inibidores efetivos de tripsina, mas somente BrTI-3 apresentou atividade inibitória também para fator Xa (Kí 3,5 nM) e calicreínas teciduais (Ki 1,5 nM e 19 nM), calicreína pancreática de porco e urinária humana, respectivamente. A seqüência de aminoácidos de BrTI-l foi parcialmente determinada. A proteína é formada por cadeia polipeptídica única e nao apresenta resíduo de cisteína. A seqüência apresenta alta ...(au)