Otimizaçäo da técnica de RT-PCR para avaliaçäo da expressäo gênica do receptor da LDL em células mononucleares periféricas de indivíduos hipercolesterolêmicos tratados com medicamentos hipolipemiantes / Optimized RT-PCR assay to evaluate LDL receptor mRNA levels in peripheral mononuclear cells from hypercholesterolemic individuals treated with lipid-lowering drugs

RESUMO

Foi otimizado o método de RT-PCR para avaliar a expressäo gênica do recptor de LDL (RLDL) em células mononucleares periféricas (CMP), provenientes de indivíduos hipercolesterolêmicos tratados com agentes hipolipemiantes. As CMP foram isoladas a partir de 10 mL de sangue periférico por centrifugaçäo sob gradiente de Ficoll-Paque Plus. O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol, ressuspendido em água tratada com DEPC e quantificado por espectrofotometria a 260 nm. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 µg de RNA utilizando a enzima SuperScript TM II RT RNAse-. A seguir, o gene do RLDL foi amplificado pela técnica de PCR. Os produtos de amplificaçäo foram avaliados por eletroforese em gel de agarose a 1,5 por cento e fotografados. Os genes da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e da ß-actina foram amplificados como controles internos utilizando a mesma metodologia descrita. A expressäo gênica do RLDL foi determinada pelas relaçöes entre a intensidade das bandas dos produtos amplificados do RLDL e GAPDH (RLDL/GAPDH) e do RLDL e ß-actina (RLDL/ß-actina), determinadas por densitometria das fotografias. Em resumo, o método otimizado permite a rápida avaliaçäo da expressäo gênica do RLDL em CMP, sem a necessidade de componentes radioativos.