PCR em embriöes bovinos: proposiçäo de modelos de treinamento / PCR in bovine embryos: proposition for a training model

RESUMO

Objetivo: Desenvolver um protocolo animal de treinamento para equipe interessada em adquirir conhecimentos e destreza técnica no manuseio de embrioes com finalidade de realizar diagnóstico pré-implantaçao através da técnica de reaçao em cadeia da polimerase (PCR). Métodos: Realizamos procedimentos, com retirada dos ovários de vacas em abatedouro, sem qualquer critério de escolha das mesmas. Os ovários após serem assépticamente retirados foram levados em cuba estéril para laboratório de fertilizaçao. Os folículos com diâmetro inferior à 8 mm foram puncionados com seringa descartável de 10 ml e agulha 21 G. Os ovócitos retirados do líquido folicular sob microscópio estereoscópio foram lavados em soluçao salina tamponada (D-PBS) e transferidos para placas "Nunc" contendo meio de cultura para maturaçao. Os ovócitos obtidos, separados para o estudo após 24 horas de maturaçao, foram fertilizados com aproximadamente 1.000.000/ml de espermatozóides e mantidos em cultivo em meio de fertilizaçao. Após fertilizados, foram transferidos para placas de co-cultura com células vero, e mantidos em incubadora com 5 por cento de C02, 20 por cento de oxigênio e 75 por cento de nitrogênio a 37º C e umidade de 90 por cento, por cinco dias. Após este período, separamos os embrioes com 8 ou mais blastômeros, aleatoriamente, em dois grupos. Um deles foi mantido em cultivo com o mesmo meio e mesmas condiçoes para servir como grupo controle, o outro foi submetido à biópsia. Após abertura da zona pelúcida, retiramos 1 ou 2 blastômeros dos embrioes, com a utilizaçao de microscópio invertido e equipamento de micromanipulaçao. Em seguida à biópsia, os embrioes permaneceram em co-cultura por mais três dias. Ao final deste tempo, avaliamos o desenvolvimento comparativamente com o grupo controle. Foi realizado estudo morfológico dos embrioes até o estágio de blastocisto ou extrusao da zona pelúcida (hatching), identificando o fenômeno de cavitaçao e estreitamento da zona pelúcida, e contagem do número de células através de coloraçao específica para núcleos com o intuito de comprovar a inocuidade da biópsia. Cinqüenta embrioes e seus blastômeros biopsiados foram submetidos a reaçao em cadeia da polimerase para identificaçao do sexo. Resultados: Dos 57 embrioes biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto, (70,2 por cento) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5 por cento). Nos embrioes co-cultivados para controle foram obtidos...(au)