Caracterizaçäo e localizaçäo da Eca N-domínio (90kDa) em cultura primária de células mesangiais de ratos SHR: possível marcador genético de hipertensäo / Caracterization and localization of N-domain angiotensin I-converting in mesangial cells from spontaneously hypertensive rats: possible marker of hypertension

RESUMO

Em trabalho anterior, foram purificadas quatro enzimas das células mesangiais (CM) de ratos Wistar em cultura ECAint1, 135 kDa; ECAInt2, 68 kDa (intracelulares) e ECA1, 130 kDa; ECA2 60 kDa (extracelulares, formas secretas de ECA). Estas enzimas foram caracterizadas como ECA por terem sido reconhecidas pelo anticorpo Y1 contra ECA de rim humano e por converterem Ai em Ali. As isoformas de baixas massas moleculares inativaram o peptídeo Angiotensina1-7 (Ang1-7) e, portanto, foram caracterizadas como isoformas N-domínio. O perfil cromatográfico obtido para estas células foi semelhante ao descrito em nosso laboratório para a urina humana de indivíduos normais e para urina de ratos normotensos Wistar Kyoto e Brown Norway, os quais apresentaram as isoformas da ECA de 190 kDa e 65 kDa, mas diferiu do perfil encontrado para a urina de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) (ECA 80 e 65 kDa; fragmentos N-terminais da ECA) e dos indivíduos hipertensos leves (ECA 90 e 65 kDa). A isoforma de 80 kDa foi sugerida como um possível marcador genético de hipertensao. Tendo como base os resultados de nosso grupo acima citados, a proposta deste estudo foi purificar e caracterizar as isoformas da ECA nas CM de ratos SHR e, desta forma, verificar se as mesmas apresentam um perfil cromatográfico semelhante ao obtido anteriormente para as urinas de pacientes hipertensos essenciais/ratos SHR, buscando evidenciar a síntese/expressao da isoforma da ECA de 90/80 kDa, que vem sendo estudada como um possível marcador de hipertensao. Outro objetivo foi localizar as isoformas de ECA tanto nas CM de ratos Wistar como nas CM de SHR. E, ainda, colocalizar estas enzimas com os peptídeos Angiotensina II (Ali) e Ang1-7. As CM de ratos Wistar e SHR (terceiro subcultivo) foram mantidas por 20 h com RPM/ sem soro bovino fetal. Após, esta etapa, o meio e as células foram coletados. O meio de cultura foi concentrado e submetido a uma gel filtraçao em resina AcA-44 equilibrada e eluída em tampao Tris-HCI 50 mM, pH 8.0, contendo NaCI 150 mM. A atividade enzimática de ECA foi detectada utilizando Hippuril-His-Leu (HHL) como substrato. As ECAs ligadas...(au)