Caracterização de marcadores moleculares em leishmania úteis para estudos taxonômicos, filogenéticos e epidemiológicos / Caracterization of molecular markers in Leishmania useful for taxonomics, phylogenetics and epidemiological studies

RESUMO

Desde a classificação do gênero Leishmania por Ross em 1903 tem sido descrito na literatura um grande número de espécies novas do parasito. Em decorrência disso e considerando a importância biomédica deste patógeno, muitos marcadores, baseados sejam em características biológicas ou moleculares dos parasitos, têm sido caracterizados em Leishmania e aplicados em estudos taxonômicos, evolutivos e epidemiológicos. Neste trabalho avaliamos o poder discriminatório de dois marcadores moleculares potencialmente úteis para, não somente, tipar, mas também determinar as relações entre as espécies de Leishmania. Os genes de ITSrDNA e NAGT foram os alvos deste estudo, tendo sido demonstrado que os perfis obtidos por PCR-RFLP destas seqüências discriminam as espécies estudadas. No entanto, a RFLP do ITSrDNA não se mostrou adequada para definir as relações entre espécies de Leishmania. Polimorfismos em sítios de restrição foram detectados nas seqüências de NAGT, revelando ser assim sinapomorfias importantes para uso no diagnóstico em nível subgenérico, sendo até mesmo capaz de separar entre espécies seja do Novo e Velho Mundo ou dermotrópicas e viscerotrópicas. Avaliamos o potencial de outro marcador para o diagnóstico das leishmanioses, tendo sido desenvolvido considerando resultados prévios obtidos por eletroforese de enzimas. Assim, o elevado polimorfismo de alelos observado no lócus de 6PGDH nos levou a seqüenciar este gene em diversas espécies de Leishmania. As análises indicaram que há um grau de concordância entre a mobilidade eletroforética e a variação na seqüência nucleotídica. No entanto, os níveis de divergência nas seqüências obtidas entre as leishmanias examinadas não apóiam a classificação da maioria como espécies distintas. Estes resultados avaliados em conjunto com dados obtidos por outras análises indicam que as espécies de Leishmania não são apoiadas, seja pelo conceito biológico, filde concordância genealógica. Sítios de restrição espécie-específicos observados nas seqüências de 6PGDH pela análise de PCR-RFLP, indicam que este gene seja um excelente marcador para uso no diagnóstico das leishmanioses. O diagnóstico molecular da doença também foi tentado explorando a molécula de minicírculo de kDNA como alvo, tendo sido possível desenhar seqüências inicializadoras que amplificam, por PCR, classes de minicírculos provavelmente específicas para L. (V.) braziliensis, o principal agente etiológico da leishmaniose tegumentar americana.