PCR-RFLP mkDNA no diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose cutânea no Brasil / PCR-RFLP mkDNA in the diagnosis and identification of causing species of Leishmania of Leishmaniasis cutaneous in Brazil

RESUMO

Neste trabalho estudamos a aplicabilidade e a capacidade da PCR-RFLP mkDNA na identificação e diferenciação de espécies de Leishmania que circulam no Brasil. Esta técnica diferencia-se das outras PCRs seguidas de restrição no produto de amplificação, por utilizar como alvo a região conservada dos minicírculos de kDNA das leishmânias... Em seguida, testamos a capacidade da PCR-RFLP mkDNA em diferenciar, também, as espécies L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni e L. (L.) chagasi, todas presentes no Brasil. Para isto, fizemos um mapa de restrição nas seqüências de DNA da região conservada dos minicírculos de Leishmania depositadas no GenBank e testamos a PCR-RFLP mkDNA em cepas referência destas espécies e em 23 isolados de Leishmania de diferentes zimodemas, que confirmaram a identidade dos parasitos. Propomos um esquema de diferenciação que contempla a maioria das espécies de Leishmania presentes no Brasil, entretanto, não conseguimos diferenciar L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis. A partir destes resultados partimos para a aplicação da metodologia em dois conjuntos de amostras clínicas. No primeiro conjunto, testamos a PCR-RFLP mkDNA na identificação de Leishmania em amostras da região endêmica para LTA do Vale do Rio Doce - MG. Os parasitos foram extraídos de uma amostra de 475 lâminas coradas pelo Giemsa, arquivadas entre 1965-2000. A PCR-RFLP mkDNA foi positiva em 395 (83,2 por cento) laminas e L. (V.) braziliensis a única espécie presente na amostra. No segundo conjunto, avaliamos o uso da PCR-RFLP mkDNA na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA de diferentes áreas endêmicas do Brasil em amostras clínicas de 329 pacientes, de 6 estados do Brasil, preservadas de diversas formas. Independente da forma de preservação, a PCR-RFLP mkDNA detectou e identificou L. (V.) braziliensis (89,0 por cento), L. (L.) amazonensis (6,4 por cento) e L. (V.) lainsoni (4,6 por cento) nas amostras clínicas. Por ser uma técnica muito sensível, de rápida execução, de fácil leitura, confirmar as caracterizações dos parasitos feitas previamente por outros métodos, sugerimos a utilização da PCR-RFLP mkDNA como um método alternativo na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA no Brasil.