Estudo da especificidade dos sítios catalíticos da enzima conversora de angiotensina I e desenvolvimento de substratos seletivos para o domínio C / Specificirty study of the catalytic sites of angiotensin I converting enzyme and development of selective substrates for C-domain

RESUMO

No presente trabalho, usamos bibliotecas combinatórias de peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência para fazer uni estudo detalhado da especificidade dos subsítios S3 a S1’ da enzima conversora de angiotensina 1 (ECA). Estes estudos permitiram o desenvolvimento de substratos seletivos para o domínio C da enzima. Para definir a especificidade do subsítio S1, ensaiamos uma primeira biblioteca com estrutura geral Abz-GXXZXK(Dnp)-0H, onde Z representa um dos 19 aminoácidos naturais (cisteína foi omitida para evitar dimerização) e X uma mistura destes aminoácidos incorporados aleatoriamente. Nossos resultados mostraram que os peptídeos contendo Arg e Leu em P1, apresentaram maior seletividade para o domínio C da enzima. As especificidades dos subsítios S1', S2 e S3 foram estudadas com as bibliotecas Abz-GXXRZK(Dnp)-OH, Abz-GXZRXK(Dnp)-OH e Abz-GZXRXK(Dnp)-OH, respectivamente. Nestas bibliotecas, um resíduo de Arg foi fixado na posição P1 para facilitar a solubilização dos peptídeos. Os nossos estudos com as bibliotecas permitiram demonstrar que o domínio C tem preferência por Phe em P1', Ile e Val em P3. Com base nestes resultados foram sintetizados os peptídeos Abz-GVILFK(Dnp)-OH e Abz-GVIRFK(Dnp)-OH, que contém os resíduos mais favoráveis em cada posição para o domínio C (P3-P1'). A redução gradativa da cadeia peptídica levou a um aumento de especificidade para este domínio. O substrato Abz-LFK(Dnp)-0H foi hidrolisado com eficiência catalítica 70 vezes maior pela ECA recombinante C-domínio (kcat/KM=36.7 M-1.s-1) do que pela ECA recombinante N-domínio (kcat/Km=0.51 M-1.s-1). Esta série de compostos foi testada também com a ECA purificada de testículo humano. Na segunda etapa do nosso trabalho estudamos uma isoforma de ECA, de aproximadamente 140 kDa, isolada de fluído de pericárdio humano. A enzima hidrolisou os substratos Abz-YRK(Dnp)P-0H (kcat=2,50s-1;Km=3,4 M; kcat/Km= 770 mM-1.s-1), Abz-LFK(Dnp)OH (kcat =2,77 s-1; Km= 7,7 M; kcat/Km= 358 mM-1.s-1) e Hip-His-Leu (kcat=1,14 s-1; Km,=1654 M; kcat/Km=0,69 mM-1.s-1)...