Comparaçåo de diferentes protocolos para a detecçåo do vírus da diarréia viral bovina por RT-PCR em grupos de sangue total e de soro sangüíneo, artificialmente contaminados / Comparison of different protocols for the bovine viral diarrhea virus detection by RT-PCR in pools of whole blood and blood serum

RESUMO

A técnica da RT-PCR foi otimizada e avaliada para a detecção da região 5`terminal não-traduzida do genoma do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) em amostras clínicas de bovinos, constituídas por soro sangüineo e sangue total, artificialmente contaminadas com a estirpe NADL do BVDV. Para a otimização da técnica foram avaliados i) dois pares de primers, 103/372 (WEINSTOCK et al., 2001) e 324/326 (VILCEK et al., 1994) ii) quatro métodos de extração do ácido nucléico (fenol/clorofórmio/álcool isoamílico; sílica/isotiocianato de guanidina; uma combinação dos dois métodos anteriores e TRIzol) e iii) diferentes concentrações e composições de reagentes, tampões e tempo/temperatura das reações. Entre todas as alternativas testadas a que resultou na amplificação de um produto com 290 pb, que foi facilmente visualizado em gel de agarose 2 por cento com brometo de etídeo, foi a que empregou as seguintes condições i) primers 372 com temperatura de anelamento de 59ºC. A utilização da RT-PCR nas condições otimizadas nesse estudo possibilitou a amplificação da estirpe NADL do BVDV (10 TCID) em pools, artificialmente contaminados, de soro sangüineo de bovinos até a diluição de 1160.