Proteínas recombinantes de amastigotas de Leishmania infantum/chagasi. Desenvolvimento/otimização de metodologias de obtenção e avaliação de antigenicidade / Recombinant proteins of amastigotes of Leishmania infantun/chagasi. Development/optimization of attainment methodologies and evaluation of antigenecity

RESUMO

O programa de controle da leishmaniose visceral no Brasil, através da eliminação de cães infectados com Leishmania, não produziu resultados satisfatórios. Além da baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos empregados e a demora entre detecção e a eliminação de cães soropositivos, este tipo de medida enfrenta a pouca aceitação por médicos veterinários e donos dos cães. Apesar do encontro de cães na área endêmica com perfil de resistência à infecção por Leishmania, sugerindo que uma vacina é possível, até o presente momento não estão disponíveis vacinas humanas ou para uso veterinário, com eficácia comprovada. Este estudo teve como objetivo a padronização ou desenvolvimento de metodologias para a obtenção e avaliação de proteínas recombinantes de amastigotas de Leishmania infantum/chagasi, potencialmente candidatas a componentes de ensaios sorológicos para diagnóstico da LV humana e/ou canina ou de uma vacina para cães contra a infecção por L. infantum/chagasi. Inicialmente foi estabelecida a melhor condição de cultivo axênico para obtenção de amastigotas extracelulares de três espécies distintas de Leishmania. Apesar de morfologicamente semelhantes às formas amastigotas intracelulares, as formas axênicas de L. infantum/chagasi não apresentaram homogeneidade quanto à viabilidade e infectividade, contrastando com o observado com as espécies L. braziliensis e L. amazonensis. Dessa forma, amastigotas purificados de baço de hamsters infectados foram utilizados para purificação do RNA e produção de uma biblioteca de cDNA de L. infantum/chagasi. Cinco antígenos recombinantes diferentes foram selecionados da biblioteca de cDNA através do uso de uma mistura de soros de cães ou de pacientes com leishmaniose visceral. Soros humanos não reativos a esses antígenos foram utilizados para identificar novos clones recombinantes, constituindo uma nova abordagem para obtenção de antígenos com potencial de aumentar a especificidade de um ensaio imunodiagnóstico. A adição dos novos antígenos elevou significativamente a sensibilidade de um ensaio “dipstick” utilizado para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana em relação a um painel limitado de soros...