Modulação da metilação de DNA por óxido nítrico durante a carcinogênese do melanoma murino / Modulation of DNA methylation by nitric oxide during mirine melanoma carcinogenesis

RESUMO

Células em um tecido estabelecem contatos com outras células e com o meio circunjacente. Qualquer abalo nestas interações é percebido e desencadeia uma série de eventos que tendem à homeostase. A perda de contato de uma célula com sua matriz extracelular dispara reações que culminam em morte celular (apoptose), resultando na homeostase do tecido de origem. Este tipo de apoptose por perda de adesão à matriz é chamada de anoikis. Entre os mediadores da morte por anoikis encontram-se os radicais livres, já que a perda do contato célula-matriz leva a um estresse químico. Entretanto, em concentrações ótimas, os radicais livres exercem função de moléculas sinalizadoras intracelulares relevantes em vários processos distintos, como sobrevivência e proliferação celulares. Uma vez que propicia a sobrevivência celular, a resistência ao anoikis é considerada uma aquisição importante para o processo carcinogênico, tanto em suas fases iniciais quanto nas tardias (por exemplo, na metastatização). Radicais livres têm sido amplamente associados à carcinogênese como agentes mutagênicos graças à propriedade de interagir diretamente coma as bases nitrogenadas do DNA. É relativamente menor o número de publicações associando radicais livres com modificações epigenéticas em tumorigênese. Por epigenética entende-se um evento capaz de influenciar a expressão gênica sem alterar a seqüência de nucleotídeos do DNA. Recentemente foi desenvolvido pelo grupo liderado pela Dra. Miriam Jasiulionis (UNIFESP) um modelo de transformação tumoral a partir da resistência ao anoikis. A linhagem de melanócitos melan-a de camundongos C57BL/6 foi usada naquele modelo experimental, que consiste no seguinte células na concentração de 1 x1 05 por ml foram submetidas ao cultivo em suspensão por 96h. Após este período de tempo, as células remanescentes (0,1 por cento) foram re-aderidas, a população foi expandida e as células foram submetidas a um novo ciclo de cultivo em suspensão por 96h. Após 2 e 4 ciclos de adesão/suspensão, as células viáveis foram expandidas e donadas por diluição limitante, originando linhagens "intermediárias", não tumorigênicas in vivo. Após 5 ciclos e outra clonagem, foram obtidas linhagens designadas de melanoma por serem tumorigênicas in vivo, representados pelos cones Tm1 e Tm5. onsiderando que a falta de contato com a matriz seja um fator de estresse, o presente trabalho propôs investigar o papel do estresse como modulador de eventos epigenéticos que ocorreriam nas fases precoces da transformação de melanócitos murinos. Células da linhagem murina normal de melanócitos melan-a foram submetidas ao cultivo independente de ancoragem por até 24h e foram comparadas com células em condições de adesão quanto a indicadores de estresse, como radicais livres (ânion superóxido, peróxido de hidrogênio, óxido nítrico) e homocisteína, produtos da peroxidação de lipídeos (malondialdeído) e da defesa antioxidante celular (glutationa). Ao longo do tempo em suspensão, as células apresentaram aumento gradual em todos os indicadores de estresse testados, com exceção de homocisteína. Com o intuito de estudar a participação de mecanismos epigenéticos na transformação celular, a metilação global do DNA das células em suspensão foi mensurada por duas metodologias distintas e comparadas com a de células ancoradas e com a das linhagens intermediárias e tumorigênicas geradas após sucessivos ciclos de cultivo em suspensão/adesão. O nível global de metilação do DNA também foi crescente em relação ao tempo em suspensão. Como o uso do inibidor de NO sintase reverteu a hipermetilação decorrente do impedimento de adesão, concluiu-se que óxido nítrico modula a metilação de DNA podendo, assim, participar da tran-sformação tumoral.