Efeito de mutações sítio-dirigidas nas hélices I, V e VI sobre a maturação, dimerização e interação com o agonista do receptor AT1 de angiotensina II / Effect of site-directed mutations in helices I, V and VI on the maturation, dimerization and interaction with agonist of angiotensin II AT1 receptor

RESUMO

Objetivos: Analisar a participação de resíduos aromáticos e alifáticos específicos encontrados na face mais externa das hélices I, V e VI do receptor AT1 na maturação, tráfego, formação do complexo agonista/receptor e dimerização. Métodos: Construção do vetor contendo o receptor A T 1 alinhado com a proteína fluorescente verde (EGFP) e realização de mutações pontuais nos resíduos V29 e 137 da hélice I, L195, L197, 1201, L202, L205 e F2o6 da hélice V e 1258, F259, F261, L262, L265 e 1266 da hélice VI para ácido glutâmico e alanina. Células HEK293 transfectadas com estas construções de forma transiente ou estável foram utilizadas para a realização dos experimentos de microscopia de fluorescência, ligação e afinidade à Ang II, BRET, análise do trafego subcelular, dimerização do receptor e experimentos funcionais através de ensaio de gene repórter. Resultados: O estudo da distribuição subcelular do receptor AT1 mostrou que o receptor selvagem encontra-se na membrana e que a substituição de resíduos para alanina, em todos os casos, não afetou sua localização, exceto no mutante L205A que foi encontrado no núcleo. Por outro lado, as mutações para ácido glutâmico, na maioria das vezes, afetaram o tráfego do receptor. Embora muitos dos mutantes da hélice V contendo ácido glutâmico tenham sido encontrados na membrana, todos os da hélice VI ficaram retidos no retículo endoplasmático. Da mesma forma, a afinidade pela Ang II nos mutantes para alanina não foi afetada, enquanto que as mutações para resultaram em diminuição da afinidade. A homodimerização do receptor A T 1 selvagem foi observada, sendo que a mutação dos resíduos em questão, que acarreta efeitos diversos não interferiu com a dimerização na maioria dos casos, como observado nos experimentos de BRET. Ensaios com o gene repórter para luciferase confirmaram a funcionalidade de alguns dos receptores mutantes do AT1 estudados aqui. É interessante que alguns mutantes para ácido glutâmico tiveram aumento na atividade da luciferase mesmo não sendo expressos na membrana plasmática como é o caso do mutante L 197E. Conclusões: Os resíduos alifáticos e aromáticos da hélice V do receptor AT1 são responsáveis por manter a configuração do sítio de ligação para Ang II. Além disso, os resultados do presente trabalho permitem sugerir que a face externa da hélice VI seja necessária para o correto dobramento do receptor AT1. Finalmente, nossos dados corroboram evidências anteriores que o receptor AT1 seja um homodímero.