Caracterização genômica da bactéria endossimbiótica do tripanosomatídeo Crithidia deanei e de suas DNA topoisomerases / Genomic characterization of the endosymbiotic bacteria of the trypanosome Crithidia deanei and its DNA topoisomerases

RESUMO

O principal objeto de estudo do presente trabalho são as DNA topoisomerases do tipo II do endossimbionte,devido ao seu papel essencial tanto nos processos replicação e transcrição,como também na recombinação e segregação dos cromossomos bacterianos.Existem duas topoisomerases do tipo II em bactérias:a DNA girase e DNA topoisomerase IV. A DNA girase introduz superenovelamento negativo no DNA circular,enquanto a topo IV tem como sua principal função a decatenação do DNA durante a segregação dos cromossomos.Para esses estudos foi gerada uma biblioteca genômica do endossimbionte em pUC18 e seqüenciados 7.500 clones inicialmente,abrangendo uma cobertura de 1,2 MB. As seqüências obtidas foram analisadas através do algoritmo BLAST.A análise mostrou que o genoma do endossimbionte apresenta uma grande homologia com os genomas de bactérias do gênero Bordetella,mas diferem no conteúdo A+T,que no genoma do endossimbionte é de aproximadamente 70por cento,enquanto que no gênero Bordetella é de apenas 32por cento.Esta estratégia permitiu encontrar as seqüências dos genes que codificam as subunidades A(GyrA)e B(GyrB)da DNA girase. Identificamos também o gene que codifica a topoisomerase III(topo III),mas não fomos capazes de identificar os genes que codificam as enzimas topo IV e I(topoisomerase I),que formam juntamente com a DNA girase e topo III o repertório de topoisomerases encontrado em outras bactérias.Baseados nas seqüências dos genes gyrA e gyrB foram desenhados iniciadores para amplificação dos alvos através de PCR.Os produtos das amplificações foram clonados para expressão em E.coli.As proteínas recombinantes foram purificadas para a produção de antissoros policlonais.Ensaio de western blot...preditas a partir da seqüência dos genes gyrA e gyrB.Análise por imunofluorescência mostrou que os antissoros contra as subunidades A e B da DNA girase reconhecem antígenos específicos do endossimbionte,inoculados por todo o citoplasma da bactéria.Os genes gyrA e gyrB também...