Métodos subsidiários para o diagnóstico da Leishmaniose tegumentar americana (LTA): comparação dos resultados do seqüenciamento de DNA e da PCR-RFLP para determinação da espécie de leishmania em amostras cutâneo-mucosas / Subsidiary methods for the diagnosis of American tegumentar leishmaniasis (ATL): comparison of sequencing of DNA and PCR-RFLP for identification of leishmania species in skin samples

RESUMO

FUNDAMENTOS: Métodos moleculares têm-se mostrados mais eficazes para o diagnóstico da LTA. OBJETIVOS: Comparar os resultados da intradermorreação de Montenegro (IRM), presença de leishmania em biópsia (Bc), reação de imunofluorescência indireta (Rifi), seqüenciamento de DNA e PCR-RFLP (-restriction fragment lenght polymorphism) para o diagnóstico da LTA. MÉTODOS: Foram estudados 152 pacientes com LTA. Para a PCR em Bc, utilizaram-se primers específicos para seqüência de 120bp do kDNA do minicírculo comum a todas as espécies de leishmanias. O produto da PCR, utilizado para seqüenciamento e para restrição enzimática com Hae III, foi comparado às culturas L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis. RESULTADOS: Houve predomínio do sexo masculino (75 por cento), da cor branca (80 por cento) e da profissão urbana (48 por cento). A idade variou de três a 77 anos, com 56,5 por cento entre 21 e 50 anos. 65,8 por cento eram do Estado de São Paulo, prevalecendo a forma cutânea (79,6 por cento). A IRM foi positiva em 73,4 por cento, e a Rifi em 59,7 por cento, enquanto a Bc evidenciou presença de leishmania em 30,6 por cento. A PCR foi positiva em 81,6 por cento, e a PCR-RFLP identificou L. (V.) braziliensis como espécie predominante (66 por cento), o que também ocorreu com o seqüenciamento. Comparando PCR-RFLP e seqüenciamento, houve 61 por cento de concordância entre os resultados, mostrando significância da PCR-RFLP para L. (V.) braziliensis. CONCLUSÕES: A IRM e a PCR foram estatisticamente equivalentes como métodos subsidiários para o diagnóstico da LTA, a PCR-RFLP e o seqüenciamento também o foram na identificação das espécies de leishmania, o primeiro apresentando menores custo e tempo de execução comparado ao seqüenciamento de DNA.

ABSTRACT

BACKGROUND: ATL is endemic in Brazil, and molecular methods have been shown more effective for its diagnosis. OBJECTIVES: Our purpose was to compare the results of Montenegros skin reaction (MR), presence of leishmania in skin biopsy (Bx), indirect immunofluorescence (IIF) for leishmania in sera samples, PCR, sequencing of DNA and PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) as subsidiary exams for ATL diagnose. METHODS: 152 patients were studied, with accomplishment of MR, Bx, IIF and PCR for leishmania in skin samples. For PCR, a specific pair of primers for a sequence of 120bp from kDNA minicircle, common to all leishmanias species, was used. The product of PCR was used for DNA sequencing and for RFLP with the enzyme Hae III. The analysis of the restriction pattern was compared to the cultures of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis. RESULTS: The predominant sex was male (75 percent), the white color (80 percent) and urban professional occupation (48 percent). The age varied from 3 to 77 years, with prevalence from 21 to 50 years (56.5 percent). In relation to the origin, 65.8 percent was from the state of São Paulo, being the cutaneous form the more prevalent (79.6 percent). MR was positive in 73.4 percent and there was presence of leishmania in 30.6 percent of the samples, while IIF presented 59.7 percent of positivity. PCR was positive in 81.6 percent of skin samples, and PCR-RFLP identified L. (V.) braziliensis (66 percent) as predominant species, fact that also happened with DNA sequencing, with 64.4 percent of the positive results for L. (V.) braziliensis. Comparing PCR-RFLP and DNA sequencing there was 61 percent of agreement amongst the results, being significant in PCR-RFLP for L. (V.) braziliensis. CONCLUSION: MR and PCR were equivalent as subsidiary methods for the diagnosis of ATL, such as PCR-RFLP and DNA sequencing in the identification of the leishmania species. On the other...