Utilização de saponina em citometria de fluxo: uma alternativa factível para permeabilização celular / Use of saponin in flow cytometry: a feasible alternative to cellular permeabilization

RESUMO

A pesquisa de antígenos intracelulares por citometria de fluxo é essencial para o estudo imunofenotípico das doenças onco-hematológicas. A utilização de saponina para permeabilização celular tem se mostrado eficaz e de menor custo. Com suas propriedades detergentes, permeabiliza a membrana citoplasmática sem danificá-la ou alterar a expressão dos antígenos de membrana, permitindo a detecção simultânea de antígenos intracelulares e de superfície. O objetivo deste trabalho foi analisar a eficácia da técnica de permeabilização celular com a utilização de saponina como agente permeabilizante. Foram avaliadas 36 amostras de sangue periférico e de medula óssea enviadas ao Laboratório de Imunopatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para estudo imunofenotípico. Realizamos a técnica de imunofluorescência direta e utilizamos o programa CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA) do citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) para aquisição e análise dos dados. Observamos excesso de perda celular quando utilizamos o tampão de lavagem estocado por período superior a sete dias, à temperatura de 2ºC a 8ºC, e perda mínima com tampão de lavagem recém-preparado ou congelado no momento do preparo e descongelado apenas no momento do uso. Para eliminar o excesso de perda celular realizamos análise sistemática das etapas da técnica, o que nos permitiu adequá-la e utilizá-la na rotina de nosso laboratório. Em país de recursos escassos padronizamos uma técnica viável para pesquisar antígenos intracelulares por citometria de fluxo, mais rápida, eficaz e com redução dos custos financeiros em 35 por cento.

ABSTRACT

Intracellular antigen investigations by means of flow cytometry are essential for immune phenotypical studies of oncohematological diseases. The use of Saponin for cellular permeabilization has proved to be cost-effective. Due to its detergent properties, Saponin permeabilizes the cytoplasmatic membrane without harming it or altering membrane antigen expressions, thus allowing simultaneous detection of intracellular and surface antigens. The objective was to analyze the efficiency of the cell permeabilization technique using Saponin as a permeabilizing agent. Thirty-six samples of peripheral blood and bone marrow underwent an immune phenotypical study at the Immune Pathology Laboratory of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo. Direct immunofluorescence was accomplished using the CellQuest program (Becton Dickinson, San Jose, CA) of the FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) to acquire and analyze the data. Excessive cell loss was observed when using rinsing buffers stored for more than seven days at temperatures ranging from 2ºC to 8ºC. Minimal cell loss was found when rinsing buffers were used immediately after preparation or frozen at the time of preparation and thawed just before use. In order to eliminate excessive cell loss, a systematic analysis of the technique stages was carried out, allowing us to restructure the technique to our purposes and its use in our laboratory. In a country with scarce resources, a viable, faster, more cost-effective technique (35 percent reduction in cost) aimed at investigating intracellular antigens by flow cytometry has been standardized.