Extracción de ADN, ARN y proteínas de células cervicales provenientes de cepillados cervicales tomados para citología cérvico-uterina / DNA, RNA and Protein extraction from exfoliated cervical cells taken

RESUMEN

Introducción: La citología cérvico-uterina (CCU) en el método más empleado en el tamizaje de lesiones precancerosas de cuello uterino. Sin embargo, la CCU tiene una proporción importante de falsos positivos y negativos, y sólo una minoría delesiones precancerosas identificadas desemboca en cáncer de cuello uterino.Objetivo: Analizar si de los cepillados cervicales es posible extraer ADN, ARN y proteínas útiles para estudios de marcadores de carcinogénesis cervical.Métodos: Se recolectaron 281 cepillados cervicales. ADN, ARN y proteínas de las células cervicales fueron extraídos empleando Trizol. Se realizó PCR para el gen de la beta globina, para evaluar el ADN extraído y RT-PCR de GAPDH y UBC, para evaluar el ARN extraído. Mediante PCR en tiempo real se cuantificó el número de copias de UBC. Las proteínas fueron cuantificadasempleando el método del ácido biscinconínico. Resultados: Nueve muestras fueron negativas para PCR de beta globina (3,2%). Otras nueve fueron negativas para RT-PCRde GAPDH (3,2%), pero 176 fueron negativas para RT-PCR de UBC. Las 105 muestras restantes fueron positivas para UBC empleando PCR en tiempo real. Las proteínas extraídas estuvieron en el rango de 30 a 4559 [mi]g/ml, dos de las 281 muestras fueron negativas para proteínas por el método del ácido biscinconínico. Conclusión: De los cepillados cervicales se puede extraer ADN, ARN y proteínas útiles para la búsqueda de marcadoresmoleculares en cáncer de cuello uterino; sin embargo, por el tipo de muestra analizado se recupera menos ARN. El usode RT-PCR de GAPDH para evaluar la calidad del ADN complementario sintetizado puede dar falsos positivos debido a la presencia de seudogen procesado. Se recomienda el uso de otros genes constitutivos como UBC.

ABSTRACT

Introduction: Papanicolau (Pap) test is the most employed screening test for precancerous cervical lesions. However, this test has an important proportion of false positives and false negatives, only a minority of the identified lesions will progress to cancer. Objective: To evaluate the remnant of cervical scrapes after the preparation of the slide as source of DNA, RNA and proteinsfor search of molecular markers of progression of precancerous lesions.Methods: DNA, RNA and proteins were extracted from 281 cervical scrapes using Trizol. To evaluate the quality of DNA a PCR for beta globine was used, RNA quality was tested by RT-PCR of GADPH and UBC genes. Real time PCR was used to evaluate the number of RNA copies of UBC gene. The protein level was obtained by the biscinconinic acid method. Results: Nine samples were negative for beta globin PCR (3,2%), 9 samples were negative for GAPDH RT-PCR (3,2%) and 176 samples were negative by UBC RT PCR , the remnant 105 were positive for UBC in real-time PCR. The extracted proteinswere in a rank between 30 and 4559 [mi]g/mL, two of 281 samples were negative for proteins. Conclusion: From cervical scrapes is possible to extract DNA, RNA and proteins usable in biomarkers research, however therecovery of RNA is lower, this can due to some characteristics inherent to the cervical cells. The use of GAPDH as in RT PCR to evaluate DNA quality can generate false positives due to the presence of a processed pseudogen, it is recommended the use of other constitutive gen like UBC.