Otimização da detecção do polimorfismo Ala 677 - Val do gene que codifica a metilenotetrahidrofolato resutase (MTHFR) / Optimization of methylenetetrahydrofolate reductase C677T polimosphism detection

RESUMO

A mutação (C677T)no gene que codifica a enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) tem sido associada à hiperhomocisteínemia e, possivelmnte, ao risco elevado para doenças vasculares. O objetivo deste trabalho foi otimizar sua detecção por PCR para facilitar estudos populacionais. Foram testadas metodologias alternativas de purificação de DNA genômico humano e os resultados obtidos permitiram padronizar uma técnica com redução de reagentes para extração do DNA por precipitação com NaCl. Foram realizdos experimentos variando a concentração dos componentes da reação de PCR que permitiram definir que reações contendo metado do volume inicial de deoxinucleotídeos e iniciadores (primers), assim como 0,5U de Taq DNA polimerase produzem essencialmente a mesma quantidade de amplificado que a reação anteriormente utilizada. Testou-se ainda, a redução do volume da reação de PCR com objetivo de utilizar o produto de amplificação diretamente para digestão com a enzima HinfI, evitando assim, etapas de pipetagem que acarrtam em risco de contaminação. Obteve-se sucesso com 15mL de volume final, o que permitiu a utilização do sistema de PCR completo para digestão do produto amplificado. A importância deste estudo pode ser justificada pela significância que as doenças vasculares apresentam em termos populacionais e por este polimorfismo estar potencialmente relacionado com o risco de DAC (doença artério-coronariana) precoce.