Desenvolvimento e avaliação de métodos moleculares para o diagnóstico da dengue / Development and evaluation of molecular methods for the diagnosis of the dengue

RESUMO

A dengue é hoje a mais importante arbovirose que afeta o homem, constituindo um sério problema de saúde pública no mundo, especialmente em países tropicais onde as condições do meio ambiente favorecem a proliferação dos seus vetores, os mosquitos do gênero Aedes. Atualmente, quase metade da população mundial vive em áreas de risco para a doença e, apesar de sua extensão e gravidade, vacinas ou tratamentos específicos ainda não estão disponíveis. Tendo conhecimento da urgência na melhoria da vigilância epidemiológica da dengue e das deficiências do diagnóstico laboratorial dessa e de outras doenças no país, realizou-se esse trabalho cujo principal objetivo foi o desenvolvimento de métodos diagnósticos baseados em técnicas moleculares de última geração para a detecção e sorotipagem do vírus da dengue. As metodologias escolhidas foram as de PCR em tempo real e de microarranjo líquido, as quais representam os mais recentes avanços na área de diagnóstico molecular. Diferentes conjuntos de oligonucleotídeos sorotipo e grupo-específicos foram avaliados quanto a capacidade de amplificar e identificar os sorotipos DENV1, DENV2 e DENV3 pelos dois métodos. Dessa forma, desenvolveu-se, baseado na técnica de PCR em tempo real, três ensaios uniplex sorotipo-específicos para dengue e um teste grupo-específico capaz de amplificar todos os sorotipos do vírus. Para o ensaio baseado na técnica de microarranjo líquido os oligonucleotídeos, após testados individualmente, foram combinados em diferentes formatos multiplex, tanto na reação de amplificação (PCR) como na de hibridação. Diferentes protocolos de hibridação foram também avaliados. Quando testada contra curvas padrões obtidas a partir da diluição de quantidades conhecidas dos três sorotipos do vírus, a PCR em tempo real mostrou-se, para todos os ensaios, capaz de amplificar e detectar mesmo a menor quantidade de vírus avaliada, equivalente a 53,57 FFU/ml. Já a sensibilidade do teste de microarranjo líquido...