Determinação das Condições Otimas para Análises de PCR-RAPD em Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae) / Determination of Optimal Conditions for PCR-RAPD Analyses in Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae)

ABSTRACT

PCR-RAPD has been widely used for genetic analysis in several organisms. However, due to complex interactions among the components of the PCR reaction it is unlikely that a single amplification condition can be suitable for all situations. In order to determine the optimum conditions for using PCR-RAPD in taxonomical analyses of the genus Atta, the following factors were tested concentrations of MgCl2, DNA, BSA, cycling programs and methods of DNA extraction, using Fractional Factorial Design and Central Composite Design. DNA extraction methods had little influence on PCR-RAPD reactions, while the cycling programs showed the largest effect. The MgCl2 concentration was less important than the amount of DNA used in the reaction. Using cycling program P2, a significant improvement in the number of DNA fragments was achieved when MgCl2 concentration was increased to 3.0 mM and the BSA and DNA concentrations were reduced from 0.1 percent to 0.05 percent and from 2 to 1 ng/mul, respectively. The optimum conditions for PCR-RAPD with Atta specimens obtained in this study were 25 mul reaction with 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 3.0 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 muM of each dNTP, 0.2 muM of primer, 1.0 U of Taq polymerase, 25 ng template DNA (extracted by Cheung's method) and BSA 0.05 percent, using the amplification program which consisted of 3 min at 94°C, 3 min at 35°C, followed by 40 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 36°C and 2 min at 72°C, and a 5 m final extension at 72°C.

RESUMO

A técnica PCR-RAPD tem sido amplamente empregada em estudos genéticos de populações de vários organismos. Entretanto, devido às interações entre os componentes da reação de PCR é improvável que uma única condição de amplificação possa ser adequada para todas as situações. Com o objetivo de determinar as condições ótimas para a utilização da técnica PCR-RAPD em análises taxonômicas do gênero Atta, foram analisados os fatores concentrações de MgCl2, DNA, BSA, programas de temperaturas e métodos de extração de DNA, utilizando-se os delineamentos Fatorial Fracionado e o Central Composto. Dentre os fatores avaliados, o método de extração de DNA teve pouca influência na reação, enquanto que o programa de temperatura apresentou o maior efeito. Embora a concentração de MgCl2 seja importante para obtenção de um padrão exato de bandas, seu efeito foi menor do que a quantidade de DNA. Com o aumento da concentração de MgCl2 para 3,0 mM e com a diminuição da concentração de BSA de 0,1 por cento para 0,05 por cento e da quantidade de DNA de 2 para 1 ng/mil ocorreu um aumento significativo no número de fragmentos amplificados, sendo esse efeito observado com maior evidência no programa P2. As condições ótimas estabelecidas para as reações PCR-RAPD foram 25 mil de solução contendo 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 100 miM de cada dNTP, 0,2 miM de primer, 1,0 U de Taq polimerase, 25 ng DNA (extraído pelo método Cheung) e BSA 0,05 por cento, utilizando-se o programa de amplificação 3 min. a 94°C, 3 min. a 35°C, seguidos de 40 ciclos de 1 min. a 94°C, 1 min. a 36°C e 2 min. a 72°C, com extensão final de 5 min. a 72°C.