Desenvolvimento de novos insumos para o diagnóstico sorológico da dengue: antígenos virais nativos e recombinantes / Development of new inputs for the serological diagnosis of dengue fever: viral antigens native and recombinant

RESUMO

A dengue é hoje a principal arbovirose tropical, em termos de morbilidade e mortalidade. É transmitida ao homem através da picada de mosquitos hematófagos de gênero Aedes e vem sendo responsável por 100 milhões de casos da doença por ano e mais de 500 mil são casos hemorrágicos e choque. A situação epidemiológica no Brasil é alarmante, pois o país contribui com 80 por cento dos casos de dengue das Américas. O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae e possui 4 sorotipos caracterizados (DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4) e até o momento não existe uma vacina disponível. As manifestações clínicas da dengue variam desde uma febre não diferenciada (DF) a casos graves de hemorragias (DHF) podendo evoluir para choque (DSS) e eventualmente óbito. Um diagnóstico rápido e eficiente pode confirmar casos suspeitos de dengue (que podem ser confundidos clinicamente com outras doenças comuns no Brasil) e direcionar tratamentos e prognósticos. Entre os testes diagnósticos para dengue, o mais comum é o ELISA (ensaio imuno-enzimático), sendo um método relativamente rápido, fácil e que pode ser realizado em um grande número de amostras. Os antígenos normalmente utilizados são partículas virais inativadas provenientes de cultura celular ou extratos brutos, como macerado de células de cérebro de camundongos infectados com o vírus, o que esbarra em limitações, tais como: variação existente entre lotes, crescente problema de bioética relacionado ao uso de animais de laboratório e risco da manipulação de material patogênico. Uma boa alternativa seria a utilização de antígenos recombinantes que pudessem substituir os utilizados atualmente, apresentando resultados reprodutíveis, menor custo e mais segurança. A fim de contribuir para melhoria do diagnóstico sorológico no Brasil, os principais objetivos deste trabalho foram: I. Obtenção de antígenos virais inativados de maior qualidade, II. Produção de um painel de antígenos recombinantes dos quatro sorotipos do vírus, III. Testar a aplicabilidade destes antígenos em testes diagnósticos sorológicos para dengue. A escolha dos antígenos se baseou na presença de anticorpos contra as proteínas virais prM, E, NS1 e NS3 no soro de pacientes com dengue. Inicialmente expressamos o epítopo B da proteína E, por ser um domínio antigênico exposto na superfície da molécula e bastante reativo com soro de pacientes. Em seguida elegemos as proteínas prM e E que foram expressas de forma quimérica e deletadas das regiões de ancoragem hidrofóbicas. Todas as proteínas foram expressas em grandes quantidades no sistema procariótico Qiaexpressionist. Dois formatos de teste foram empregados: ELISA e imunodetecção em membranas (Western-blots), usando 44 soros de pacientes positivos e negativos para dengue, e soros de pacientes vacinados contra febre amarela. Foram realizados em paralelo, com mesmo painel de soros, testes com o kit de BioManguinhos (macerado de cérebro de camundongo como antígeno) e o kit comercial PanBio. Os resultados obtidos com o antígeno viral nativo foram 90,9 por cento concordantes, sendo que os antígenos nativos se mostraram mais sensíveis e específicos. Os antígenos recombinantes foram utilizados em testes tipo ELISA direto e em imunodetecção em membranas, com os mesmos soros. Os resultados foram bastante promissores e estão sendo padronizados.