Aplicação da pesquisa de anticorpos IgG anti-formas promastigotas vivas de Leishmania (V. ) braziliensis, por citometria de fluxo, em estudos clínicos da Leishmaniose cutânea localizada / Application of antibodies IgG anti-living promastigotes of Leishmania (V. ) braziliensis by flow cytometry in clinical studies of localized cutaneous leishmaniasis

RESUMO

Este estudo se refere ao desenvolvimento de uma nova metodologia, fundamentada na pesquisa de anticorpos IgG anti-formas promastigotas vivas de Leishmania (V.) braziliensis, por citometria de fluxo-AAPV-IgG para diagnóstico e monitoramento de cura da leishmaniose cutânea localizada-LCL. Em uma primeira etapa de padronização do método, ficou estabelecida a nova metodologia que permite discriminar a reatividade de IgG do soro de pacientes portadores de LCL(L+) daquela observada para indivíduos sem manifestação clínica de LCL(L-), empregando-se em cada teste: a) 500.000 promastigotas vivas de 10 dias de cultivo; b) soro teste na diluição 1:1.024; c) anticorpo secundário anti-IgG humano-FITC na diluição 1:400; d) ambas incubações a 37ºC por 30 minutos e e) o valor do percentual de parasito fluorescentes positivos-PPFP de 60 por cento como ponto de corte entre resultados positivos e negativos. Em uma segunda etapa, foi feita a avaliação comparativa do desempenho do método proposto e de um método tradicional, a Reação de Imunofluorescência Indireta-RIFI. A análise dos índices de desempenho expressos em percentual (sensibilidade, especificidade, valores preditivos, probabilidade de doença pós-teste negativo, taxa de falso-positivo, acurácia e Índice J de Youden) e a Razão de Verossimilhança-RV demonstrou a melhor performance da AAPV-IgG em relação à RIFI, na identificação de casos de LCL em atividade clínica. A análise das RVs demonstrou que os títulos da RIFI foram desprovidos de valor diagnóstico enquanto que na AAPV-IgG, valores de PPFP>60 por cento contribuem para a confirmação do diagnóstico da LCL e valores de PPFP£60 por cento praticamente excluem o diagnóstico de LCL. Posteriormente, foram feitas simulações com situações clínicas que podem concorrer para falso-positividade ou falso-negatividade do teste em estudo. O tempo de duração da lesão na LCL, casos de leishmaniose visceral-LV e doença de Chagas-DC foram identificados como situações clínicas capazes de interferir no desempenho da pesquisa AAPV-IgG aplicada ao diagnóstico da LCL, uma vez que podem apresentar resultados falso-negativos e falso-positivos, respectivamente. Considerando a queda no desempenho da AAPV-IgG na identificação de LCL numa amostragem populacional que inclui LV e DC, foi proposta a avaliação do desempenho da quantificação das subclasses de IgG no esclarecimento de situações positivas no teste original. A análise combinada da AAPV-IgG1/IgG2 mostrou-se útil no esclarecimento de situações positivas no teste original, quando aplicado numa amostragem populacional que inclui LV e DC. O estabelecimento do ponto de corte de 60 por cento de PPFP para AAPV-IgG1 e de 50 por cento de PPFP para AAPV-IgG2 permitiu o esclarecimento de 93 por cento das situações AAPV-IgG positivas que não apresentavam LCL e confirmar 100 por cento dos casos de LCL em atividade clínica. A análise das RVs demonstrou que um resultado positivo na análise combinada praticamente confirma a presença de LCL e que um resultado negativo praticamente confirma a ausência de LCL. Finalmente, foi demonstrada a utilidade da AAPV-IgG no monitoramento precoce e tardio da cura pós-terapêutica específica da LCL. Observou-se que, que 71 por cento dos pacientes sem recidivas após 2 anos do tratamento foram identificados precocemente (30d-PT), com queda na reatividade de PPFP, superior a 10 por cento, na diluição do soro 1:4.096.