Desenvolvimento de um modelo de avaliação de protótipos vacinais em linhagem de monócito humana (THP-1) / Development of an evaluation model prototype vaccine strain in human monocyte (THP-1)

RESUMO

As culturas de células vêm sendo utilizadas extensivamente no desenvolvimento e na produção de uma variedade de produtos terapêuticos e profiláticos, tornando-se uma ferramenta indispensável para geneticistas, imunologistas, vacinologistas e a indústria farmacêutica. A adoção de sistemas de ensaios celulares in vitro tem sido aplicada como um método alternativo para a substituição ou diminuição do uso de animais nas fases de desenvolvimento, produção e testes de vacinas, demonstrando resultados promissores. Da mesma forma, sistemas computacionais podem ampliar a utilização desta ferramenta para etapas do desenvolvimento de vacinas candidatas na fase pré-clínica. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um protocolo in vitro utilizando culturas de células humanas – a linhagem de monócitos THP-1, para a seleção de um protótipo vacinal – a cepa Pasteur de Mycobacterium bovis BCG expressando o antígeno Sm14 de Schistossoma mansoni (BCG/sm14). Para isso foram empregadas duas metodologias – citometria de fluxo e imunocitoquímica, para a identificação do perfil da expressão das citocinas IL-10, IL-12 e TNF- alfa. Foram utilizados como controles a cepa Pasteur do M. bovis BCG e a construção da cepa Pasteur do M. bovis BCG contendo o vetor de expressão pAU5 (BCG/pAU5). Após padronização, a multiplicidade de infecção utilizada para os experimentos foi de 10 bacilos para 1 célula THP-1 (10MOI). A expressão da proteína Sm14 foi detectada em todos os protótipos vacinais. Para assegurar que o protótipo BCG/sm14 era capaz de diferenciar a linhagem de monócitos THP-1 em macrófagos, avaliamos a taxa de crescimento celular e foi possível observar que após a infecção estas células apresentavam o índice de proliferação diminuído em 2 logs em relação à célula não infectada. O protótipo vacinal BCG/sm14 não mostrou diferenças quanto a capacidade de infecção, a taxa de persistência intracelular e a estabilidade da construção plasmidial. As duas metodologias empregadas mostraram resultados discrepantes em relação ao percentual de citocinas expressas após a infecção com o protótipo vacinal ou BCG controles, mostrando um maior percentual de células positivas quando avaliados por citometria de fluxo. Contudo, mesmo com esta diferença observamos que o protótipo vacinal BCG/sm14 não alterou o perfil de expressão de IL-10, IL-12 e TNF-alfa. O fato do plasmídeo pAU5 ser um vetor de expressão citoplasmática, sugere que a proteína Sm14 não foi capaz de estimular a mudança de citocinas em monócitos humanos. Experimentos futuros, devem investigar o papel do BCG/sm14 em macrófagos maduros, quanto a indução de citocinas pró e anti-inflamatórias, TLR, bem como na indução da resposta imune adaptativa, como a apresentação antigênica, na tentativa de melhor entender a resposta imune a esta vacina candidata.