Desenvolvimento e implementação de métodos laboratoriais aplicados ao diagnóstico fenotípico e genotípico do Corynebacterium diptheriae / Development and implementation of laboratory methods applied to phenotypic and genotypic diagnosis of Corynebacterium diphtheriae

RESUMO

A emergência de cepas de Corynebacterium diphtheriae atoxinogênicas como agentes de endocardite e outras infecções sistêmicas aliada ao aumento do número de adultos susceptíveis à difteria enfatizam a necessidade de métodos alternativos para o diagnóstico laboratorial desta doença, especialmente para laboratórios de rotina clínica. Neste estudo avaliou-se a atividade de DNase de 91 amostras de C. diphtheriae (37 toxinogênicas e 54 atoxinogênicas) e de 564 cepas clínicas de bacilo Gram positivo não diftérico. A atividade de DNase foi detectada em todas as amostras de C. diphtheriae examinadas, previamente identificadas por métodos bioquímicos e pelo sistema API Coryne System. Diferentemente, os resultados do teste de DNase foram negativos em 93.9 porcento das cepas clínicas de bacilo Gram positivo não diftérico. Também foi documentado o valor de uma PCR espécie-específica que tem como alvo o gene dtxR como um método para diferenciação entre C. diphtheriae e colônias similares ao gênero Corynebacterium. Os resultados da PCR-dtxR foram positivos para todas as amostras de C. diphtheriae estudadas e foram concordantes com os obtidos através de metodologia bioquímica padrão. Diferentemente, os resultados da PCR-dtxR foram negativos para 100 porcento das 111 amostras de bacilos Gram positivos não diftéricos estudadas. A partir destes resultados, uma PCR multiplex utilizando três pares de oligonucleotídeos iniciadores foi desenvolvida para a detecção do C. diphtheriae e diferenciação em amostras toxinogênicas ou atoxinogênicas. Dois pares de oligonucleotídeos iniciadores têm como alvo as regiões do gene tox relativas aos domínios A e B da toxina diftérica e um terceiro par direcionado para o gene dtxR. Todas as amostras de C. diphtheriae foram identificadas pela reação de PCR multiplex em concordância com os testes bioquímicos padrão e os ensaios de citotoxicidade celular...

ABSTRACT

The emergence of non-toxigenic Corynebaterium diphtheriae strains as the causative agent of endocarditis and other systemic infections and the significant rise in the percentage of adults susceptible to diphtheria emphasize the need for new laboratory diagnostic procedures. In this study, we examine techniques as alternative procedures for differentiating C. diphtheriae from Corynebacterium-like colonies for the presumptive identification of this pathogen, especially in the diagnosis laboratory. This study evaluated the DNase activity of 91 C. diphtheriae (37 toxigenic and 54 non-toxigenic) and 564 non-diphtherial Gram-positive rod clinical strains. The DNase activity was detected in all C. diphtheriae strains examined, previously identified by both conventional biochemical methods and API Coryne System. Conversely, DNase test results were negative in 93.9 percent of the 564 non-diphtherial Gram-positive rod clinical strains. We also documented the value of a species-specific PCR assay that targets the dtxR gene as a procedure for differentiating C. diphtheriae from Corynebacterium-like colonies. The results of the PCR-dtxR were all positive for 91 C. diphtheriae strains and completely correlated with the standard biochemical methods and commercial identification system for all strains tested. In other hand, the PCR-dtxR results were negative in 100 percent of the 111 non-diphtherial Gram-positive rod strains. Considering these results, a multiplex PCR using three primers pairs was developed for detection of C. diphtheriae infection and differentiation between toxigenic and non-toxigenic strains. Two primer pairs targeted to domains A and B of tox gene and a third primer pair targeted to a region of dtxR gene. All C. diphtheriae strains were diagnosed by the multiplex PCR in agreement with standard biochemical tests and citotoxicity assay in Vero cells. Thus, these tecniques emerged as viable, cost-effective screening methods for C. diphtheriae laboratory...